SN_T 1632.3-2013出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法 第3部分：荧光PCR方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1632.3—2013代替SN/T 1632.32005出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法　第 3部分：荧光PCR方法Determination of Enterobacter sakazakii(Cronobacter spp.)from dehydratedpowdered milk for export-Part 3: Real-time PCR method2014-06-01实施2013-11-06 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局站刮甜涂查真伪 SN/T 1632.3--2013前言SN/T1632《出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法》共分为3个部分：第1部分：分离与计数；—第 2 部分:PCR方法;第3部分：荧光PCR方法。本部分为SN/T1632的第3部分。本部分依照GB/T1.12009给出的规则起草。本部分代替SN/T1632.3-2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分：荧光PCR方法》。本部分与SN/T1632.3--2005相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：一修改了标准的中英文名称;修改了引物和探针；-删除了定义、术语和缩略语；增加了克罗诺杆菌属内种的分型鉴别方法的资料性附录。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本部分主要起草人：赵贵明、王娉、吕敬章、陈颖、杨海荣、赵勇胜、高旗利、张霞、刘培。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1632.3—2005.I SN/T 1632.3—2013出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属）检验方法　第 3部分：荧光PCR方法1 范围SN/T1632的本部分规定了奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）的荧光PCR检测方法。本部分适用于奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属)的快速定性检测，其他食品可参照执行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1632.1出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第1部分：分离与计数SN/T1632.2—2013出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第2部分：PCR方法3测定方法3.1方法提要奶粉经增菌后,取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，以8-000 r/min 的转速离心5min,轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干蔽体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干；加入50μLDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混勾后沸水浴5·min，以12000r/min的转速离心5min，取上清液作为模板进行荧光PCR增，观察荧光PCR仪的实时曲线，从而对奶粉中的阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属)进行快速检测。3.2试剂和材料见SN/T1632.1。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。3.2.1引物：5-GGCGAGCGGCGAATATTAT -35′-CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC -33.2.2探针：5′-FAM-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-BHQ-33.2.3 Eα Taq DNA 聚合酶。3.2.4dNTPs:dATPdTTP、dCTP、dGTP。3.2.51DNA提取试剂：0.1%Chelex100(螯合树脂)水溶液。3.2.610×PCR缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4),200 mmol/L 氯化钾,15 mmol/L 氯化镁。3.2.7FastSartUniversal Probe Master(2 X ) .3.2.8阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）质控菌株：ATCC29544，或等效菌株。3.2.9仪器和设备。3.2.10荧光 PCR仪。 SN/T 1632.3—20133.2.11 离心机:20 000 r/min。3.2.12 移液器:10 μl、100 μL、200 μl.、1 000μL3.2.13水浴锅。3.3操作步骤(流程见附录A)3.3.1前增菌和增菌取检样100g加人已预热至45℃装有900ml.灭菌水的锥形瓶中，振摇使样品充分溶解，36℃士1℃培养 18 h～22 h。移取 1mL转种于 10 ml改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤中（MLST，见SN/T 1632.2—2013 中 A.1),36℃±1℃培养 18 h～22 h。3.3.2模板DNA准备每瓶培养的MLST分别取1mL加到1