NY_T 2289-2012小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2289—2012小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法Detection and identification of Tilletia controversa Kihn2013-03-01实施2012-12-24发布中华人民共和国农业部发布 NY/T2289—2012前言本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)归口。本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、四川省植物检疫站、重庆大学。本标准主要起草人：王福祥、刘可、王中康、宁红、熊红利、殷幼平、刘慧、李潇楠、万佳I NY/T2289—2012小麦矮腥黑穗病菌检疫检测与鉴定方法1范围本标准规定了农业植物检疫中小麦矮腥黑穗病菌（TilletiacontroversaKuhn，TCK）样品采集、样品处理、实验室形态学、实时荧光PCR检验及结果判定和除害处理的技术方法。本标准适用于小麦种子、籽粒及产品、生长期植株小麦矮腺黑穗病菌的检疫检测和鉴定2规范性引用文件DPUBLAS下列文件对于本文件的应用件，仅注日期的版本适用于本文其長版ISHING件。凡是不注日期的可用文文件NDAGB 7412小麦地GB15569业刀RESEARCHAR矮GB/T1808南检3术语和定义S义适用下列术语和A3. 1穗症小麦矮腥黑Dwarfbumtdiseas黑穗病由小麦矮腥引起的麦类真菌现为罹病植ersaKuhn1量损失工影变为用，导致卜麦加工产品株矮化，病穗麦响成工品质。33. 2Renulum heighe网脊高度值指腥黑穗病子外胞壁的刺状Y或齿状突起的垂U3.3人PCRO-PCE实时荧光定量也叫实时荧光聚合配反应。的特殊D段，在扩增过程中由于能在荧光物质的释放而实时快速灵敏地检出模板ONA石在的3. 4Q-PCR阈值ThresholdofO-PCRPCR反应实时荧光强度超过背景荧光强度的值或检测值，3.5Q-PCRCt值直CyclethresholdvalueofQ-PCR实时荧光PCR反应检测样品的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数3. 6典型的扩增曲线Typicalamplificationcurve个典型的扩增曲线由三个阶段组成：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。指数扩增阶段PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。1 NY/T2289—20123.7荧光染料SYBRGreenI非特异性结合双链DNA的一种荧光染料，其荧光信号随着dsDNA扩增产物的增加而增强。4原理小麦矮腥黑穗病菌（TilletiacontroversaKuhn，TCK），属担子菌门Basidiomycota，冬孢菌纲Teliomycetes，黑粉菌目Ustilaginales，腥黑粉菌科Tilletiaceae，腥黑粉菌属Tilletia。病菌主要对小麦、大麦、黑麦等禾本科18属的农作物和杂草形成系统侵染，被侵染作物结实时形成菌瘦。病菌以冬孢子附着在种子外表或混人粪肥、土壤中越夏，随着受害种子、土壤和肥料的远距离运输而传播；也可以菌瘘形式混杂于种子中，远距离传播。小麦矮黑穗病菌的冬孢子形态、Q-PCR反应结果是本标准快速鉴定该病原菌的依据。4.1冬孢子形态小麦矮腥黑穗病菌冬孢子呈球形、椭圆形或不规则形，具网状饰纹和无色到淡色的胶质鞘，直径（含胶质鞘）为16.80um~32.19um，通常为18um~24um。冬孢子网脊高度值是小麦矮腥黑穗病菌和其近似种小麦网腥黑穗病菌（TilletiacairesTul.，TCT)冬孢子最重要的区别特征，前者的网脊高度值为1.43μm士0.14μm，后者为0.53μm士0.19μm。冬孢子自发荧光和萌发生理试验也可以作为进一步鉴定的依据。4.2 Q-PCR本标准采用Q-PCR荧光染料法进行检测。利用病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料结合dsDNA扩增产物而发出荧光，由荧光检测器实时检测。由于初始模板量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测阈值时所经历的Ct值不同，因此在模板定量的情况下，Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量，实现定量PCR检测5试剂与材料除特别说明以外，本标准所用样品制备试剂均为分析纯，5.1冬孢子形态检验试剂吐温-20（Tween-20）、乙酸钾（CH3COOK）、甘油（CHgO）、乙醇（CzH,OH）、柠檬酸（CsHgO）、蒸馏水（H2O）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）。5.2Q-PCR检验试剂淀粉酶（Amylase）、液氮（N2）、磷酸盐缓冲液、冬孢子裂解液、DNA释放剂、DNA提取液、TE缓冲液、DNA洗涤液、SYBRQ-PCR反应混合液等，Q-PCR检验