SNT 1871-2007美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1871—2007美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法Identification of Monilinia fructicola (Winter) Honey2007-10-16实施2007-04-06发布x查询血中华人民共和国度技15发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1871—2007前言本标准的附录 A、附录B和附录 C均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：吴品珊、严进。本标准系首次发布的行业标准。 SN/T 1871—2007美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了植物检疫中美澳型核果褐腐病菌［Monilinia fructicola（Winter）Honey]的检疫鉴定方法。本标准适用于针对美澳型核果褐腐病菌的核果类等蔷薇科果实和苗木的检疫。2 原理2.1分类地位英文名 : pathogen of blown-rot-pathogen-of twig cankerr,pathogen of American brown rot of stonefruit学名:Monilinia fructicola （Winter) Honey曾用名：Sclerotinia fructicold（Winter）Rehm无性态:Monilia fructicola Batra美澳型核果褐腐病菌［Monilinia fructicola（Winter）（Honey」属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota）子囊菌纲（Ascomycetes），柔膜菌目（Helotiales），核盘菌科（Sclerotiniaceae），链核盘菌属（Monilinia）。病菌既能在果园引起危害，又能为害储藏期果实。它还可对果实进行潜伏侵染，使病菌在储藏期继续传播扩散，造成严重损失。能引起核果类等水果褐腐病的真菌还有核果褐腐病菌Monilinia lara 和出欧洲种仁果褐腐病菌 Moniliniafructigena，它们不仅能引起相似的症状，在形态上也与 Moniliniafructicola 近似。病菌在世界上的分布和寄主植物参见附录 Al2.2鉴定原理根据美澳型核果褐腐病菌在寄主上的症状、形态学特性、生物学特征和 PCR特异性扩增片段做为鉴定依据。3仪器和用具3.1仪器生物显微镜（具测量功能），体视显微镜，超净工作台光照生物培养箱，天平，高压灭菌器，台式高速离心机，pH计，水浴箱,PCR扩增仪，电泳仪,凝胶成像仪。3.2用具塑料盒，测量用尺子，烧杯，三角瓶，量筒，试管，培养皿（直径9cm），载玻片，盖玻片，酒精灯，黑光灯（18W,320 nm～380 nm），塑料研杆，移液器，移液器吸头，离心管，液氮罐。4　试剂和培养基4.1试剂琼脂粉,乳酸,马铃薯，葡萄糖，琼脂糖，无菌双蒸水，液氮，V8 液，CaCO，SDS，Tris-HCI,MgCl2，HCI,EDTA,NaOH,NaOAC,KCl,Tris,CTAB,TBE,无水乙醇（Ethanol),苯酚（Phenol)，溴化乙锭（EB），三氯甲烷(Chloroform），异丙醇（Isopropanol），异戊醇（Isoamyl alcohol)，蛋白酶K，Taq聚合酶，dNTP,DNA 分子量 Marker（100bp）,特异性引物 ITS1-Mfcl 和 ITS4-Mfcl。 SN/T 1871--20074.2培养基微酸性水洋菜培养基，马铃薯葡萄糖培养基（PDA），V8培养基。5鉴定方法5. 1 症状检查检验苗木时，重点查验枝梢和叶部。症状为枯萎和溃疡，溃疡斑长圆形，中央稍凹陷，灰褐色，边缘紫褐色，有时发生流胶，潮湿条件下，病斑上可产生分生孢子梗束；叶部症状为干枯调萎；如有花，则变褐、干枯或腐烂。剪取有疑似症状的枝、叶或花做分离培养。在果实检验时,取有褐色病斑的果做分离培养。冷库储藏期的病果，病斑为黑褐色，温度适合时病斑迅速扩大至全果，果肉随之变软、腐烂，或皱缩、干癌成僵果。潮湿条件下，表面产生同心轮纹状排列的灰白色至灰褐色霉层，其上产生分生孢子梗束。被潜伏侵染的果，有些表面有微小的圆形的坏死斑点，出现灰白色轮纹状霉层。5.2保湿培养无上述明显症状的果或看似健康的果，做保湿检查。果实在密闭的塑料盒中，20℃～25℃下保湿培养，7d后每天开始检查，直到第14天，出现褐腐病斑症状的果做分离培养。5.3分离培养从病健交界处切取边长为5mm～10mm的样品，70%酒精消毒10s～30 s，放在微酸性培养基上，25℃培养，待菌落出现，镜检。如菌落、菌丝和分生孢子的形态特征与M.fructicola 相似，则立即转到PDA Ⅲ上。5.4生物学鉴定将转到PD