NY_T 3309-2018肉类源性成分鉴定实时荧光定性PCR法.pdf

ICS 67.120B 45NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 3309—2018肉类源性成分鉴定实时荧光定性PCR法Identification of animal-derived materials in meat-Qualitative realtime PCR method2019-06-01实施2018-12-19 发布中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3309—2018前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东省食品药品检验研究院。本标准主要起草人：步迅、张全芳、刘艳艳、范阳阳、霍胜楠、张卉、马德源、下如如、陈杰、杨雪、李燕、杨连群。I NY/T 3309—2018实时荧光定性PCR法肉类源性成分鉴定1范围本标准规定了对羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物源性成分进行鉴定的实时荧光PCR法。本标准适用于生鲜肉、冷冻肉及肉制品中羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物源性成分的鉴定。本方法检出限为1%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T9695.19肉与肉制品取样方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测农业部2406号公告—72016转基因动物及其产品成分检测DNA提取和纯化方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1实时荧光PCRqualitativerealtimePCR在PCR反应体系中加人荧光基因，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。3. 2 Ct 值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间保守区设计通用引物，在可变区设计物种特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物源性成分。5试剂或材料除另有规定外，仅使用分析纯试剂。5.1 水:GB/T6682,一级。5.2生理盐水：称取0.85gNaCl加20mL水溶解，然后加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min。5.31mol/LTris-HCl(pH6.4)溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用浓HCl调节pH至6.4，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用，1 NY/T3309—20185.410mol/LNaOH溶液：称取80gNaOH溶解于160mL水中，冷却至室温，再加水定容至200mL。5.50.5mol/LEDTA-Naz（pH8.0）溶液：称取18.6gEDTA-Na2溶解于70mL水中，用10%的NaOH溶液，调节pH至8.0，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min，室温保存待用。5.610%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液：称取10g SDS溶解于80mL灭菌水中，加热至完全溶解后，冷却至室温，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。5.75mol/LNaCl溶液：称取29.22gNaCl溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。5.8细胞裂解液(Lysis Buffer):取1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液20mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液5mL，5.0mol/LNaCl溶液10mL，10%SDS溶液5mL，加水定容至100mL，混匀。5.920mg/mL蛋白酶K溶液：称量0.2g蛋白酶冻干品，加无菌水溶解，加水定容至10mL，分装后于一20℃保存。5.10RNA酶溶液：将1g冻干品RNA酶A溶解于6mL无菌水中，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，加水定容至10mL，分装成小份存于一20℃。5.11氯仿十异戊醇混合液：将氯仿和异戊醇按照24十1的体积比例配制。5.1270%乙醇：量取70mL无水乙醇，加人30mL水。5. 13TE缓冲液:将 0. 5 mL的 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 0)溶液、0. 1 m