SCT 7202.2-2007斑节对虾杆状病毒诊断规程 第2部分：PCR检测法.pdf

ICS 65.020.30B 41Sc中华人民共和国水产行业标准SC/T 7202.2-2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第 2 部分：PCR 检测法Diagnostic Protocols for Penaeus monodon-Type Baculovirus (MBV)of Penaeid Shrimp-Part 2: PCR Method2007-06-14 发布2007-09-01实施中华人民共和国农业部3发布 SC/T 7202.2—2007前言SC/T 7202《斑节对虾杆状病毒病诊断规程》分为三个部分：第1部分：压片显微镜检查法；第2部分:PCR检测法；-第3部分:组织病理学诊断法。本部分为SC/T 7202的第2部分。本部分的附录 A和附录 B为规范性附录,附录 C为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦。I SC/T 7202.2—2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第 2 部分:PCR 检测法1警告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验,本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。2范围SC/T 7202 的本部分规定了斑节对虾杆状病毒病PCR 检测法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分适用于进行病原筛查和疾病的确诊。其中核型多角体基因保守序列法仅适用于对虾,包括对虾活体、粪便,以及冰冻和冰鲜虾产品的 MBV 的筛查和疾病的初步诊断。单独使用时不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。3规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本适用于本标准。SC/T 7202.12007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程第 1 部分:压片显微镜检查法SC/T 7202.3-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第 3 部分:组织病理学诊断法4　原理4.1 斑节对虾杆状病毒病的病原和病理学特征见 SC/T 7202.3—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)中 3.1 的规定。4.2技术原理聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是以待测样品的一段 DNA作为模板,以与模板两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物,在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下,利用依赖 DNA的DNA聚合酶的合成作用。经过数十次变性、退火和延伸的反应循环,使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性地级数扩增,再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段，从而可揭示微量病毒 DNA 的存在。套式 PCR 是在第一步 PCR 扩增的产物内,再用一对引物进行第二步 PCR 扩增。5试剂和材料5.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.2无水乙醇。5.3液体石蜡。5.4含氯消毒剂:医用品或水产药物。5.5 琼脂糖:电泳级。5.61kb DNA 分子量标准:生化试剂。1 SC/T 7202.2--20075.710×PCR 缓冲液:生化试剂,随 TaqDNA聚合酶提供，一20℃保存。5.8 MgCl2(25 mmol/L):生化试剂,-20℃ 保存。5.9 dNTP(10 mmol/L):生化试剂,含 dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 10 mmol/L 的混合物，-2℃ 保存。5.10TaqDNA 聚合酶(5U/μL):生化试剂，-20℃保存。5. 11 10 μmol/L引物 F1:5-ACY-TAY-GTG-TCA-GAC-AAC-AAA-TAY-TAC-AAA-3,序列含有简并碱基,其中:Y=T或 C,用于杆状病毒多角体基因保守序列法，-20℃保存。5. 1210 μmol/L 引物 R1:5-GGY-GCG-TCK-GGY-GCA-AAY-TTY-TTW-ACY-TTR-AA-3,序列含有简并碱基,其中:Y= T或 C,K=T 或 G,W=A或 T,R=A或 G,用于杆状病毒多角体基因保守序列法,～20℃保存。5.13TE缓冲液按附录A的规定执行。5.14抽提缓冲液按附录A的规定执行。5.1510 mol/L 乙酸铵按附录 A的规定执行。5.16平衡酚按附录 A规定执行。5.17酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)按附录A的规定执行。5.181×