SN_T 3731.2-2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第2部分：鹅成分检测 　PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3731.2--2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第2部分：鹅成分检测PCR 法Identification of poultry ingredient in food and feed--Part 2 : Detection of anser ingredientPCR method2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3731.2-2013前言SN/T3731《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法》共分为以下6个部分：第1部分：鹤鹑成分检测　PCR法：第2部分：鹅成分检测　PCR法：-第3部分：鸽子成分检测实时荧光PCR法：第4部分：火鸡成分检测实时荧光PCR法；第5部分：鸭成分检测PCR法；一第6部分：鹧鸪成分检测　实时荧光 PCR法。本部分为SN/T3731的第2部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：宗卉、花群义、韩建勋、汪燕玲、曹琛福、吕建强、吴亚君、卢体康、阮周曦、秦智峰。1 SN/T 3731.2—2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第 2部分：鹅成分检测　PCR 法范围1SN/T3731的本部分规定了食品及饲料中鹅成分检测的PCR方法。本部分适用于食品及饲料中鹅成分的定性检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1多聚酶链式反应polymerase chain reaction; PCR一种体外扩增 DNA 的方法。PCR使用一种耐热的多聚酶，以及两条含有 20 个左右碱基的单链引物。经过高温变性将模板DNA分离成两条链，低温退火使得引物和一条模板单链结合，然后是中温延伸，反应液的游离核苷酸紧接着引物从5°端到3′端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环,因此 DNA 的数相不断倍增。3.2Taq DNA 酶 Thermus aquaticus DNA polymerase从 Thermus aquaticus 细菌中提取的耐热 DNA-聚合酶。4缩略语下列缩略语适用于本文件，dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）CTAB:十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane}EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)DNA Marker:核酸相对分子质量标准5方法提要样品经研磨混匀后，提取 DNA,以 DNA为模板,采用鹅线粒体 D-Loop区基因特异性检测引物进1 SN/T 3731.22013行PCR扩增，经电泳，在309 bp大小处观察是否有扩增条带，必要时进行测序，来判断样品中是否存在鹅成分。6试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器分装。6.1检测用引物(对)序列鹅成分扩增引物详见表1。表 1 试验用引物名称目的基因序列(5-3)鹅成分5端引物F:5-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3鹅线粒体D-Loop区基因R:5-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3鹅成分3端引物6.2试剂6.2.1裂解液:1% CTAB;0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0);0.7 mol/L NaCl;0.01 mol/L EDTA(pH8.0)6.2.2DNA 聚合酶。6.2.310×PCR 缓冲液。6.2.4硫酸镁。6.2.5dNTP混合液。6.2.675%乙醇。6.2.7三氯甲烷。6.2.8异丙醇。6.2.9电泳缓冲液:Tris 54 g，硼酸 27.5 g,0.5 mol/L EDTA·Tris-HCI(pH8.0)20 mL，加蒸馏水至1 000mL:使用时10 倍稀释。6.2.10溴化乙锭（或等效染色剂）。6.2.11上样缓冲液。7仪器和设备7.1离心机（最大离心力大于12000 g）。7.2 微量移液器(100 μL~1 000 μL,20 μL~200 μl,2 μL～20 μL,0.