WST 56-1996尿中对氨基酚的高效液相色谱测定方法.pdf

中华人民共和国卫生行业标准尿中对氨基酚的高效液相色谱测定方法WS/T56-1996Urine-Determination of p-aminophenol --Highperformance liquid chromatographic method1主题内容与适用范围本标准规定了尿中对氨基酚(PAP)的高效液相色谱测定方法。本法最低检测浓度为0.5mg/L。本标准适用于接触苯胺的工人尿中对氨基酚的测定。2原理尿样加盐酸加热水解后，酸性下用乙酸乙酯萃取，除去部分干扰物，然后在中性溶液中，用乙酸乙酯萃取尿样中对氨基酚，反相C18柱分离，在254nm波长下测定。以保留时间定性，峰高定量。3仪器3.1高效液相色谱仪，紫外检测器。3.2恒温水浴。3.3全玻璃磨口蒸馏器，2L。3.4微量注射器，10μL。3.5容量瓶，100mL。3.6具塞刻度试管，25mL。3.7玻璃瓶，200～500mL。3.8尿比重计。4试剂本标准所用试剂，除另有说明者外，均为分析纯级试剂。4.1实验用水，为去离子水或经全玻璃蒸馏器重蒸馏的水。4.2盐酸，优级纯，P2o=1.19g/mL。4.3磷酸氢二钾。4.4甲醇,重蒸的。4.5乙酸乙酯。4.6对氨基酚，升华精制，避光保存。4.7对氨基酚标准溶液：准确称取8.0mg精制对氨基酚（4.6），加水溶解并加入4滴盐酸（4.2），加水稀释至100mL。此溶液1mL相当于80μg对氨基酚。4.8质控样：用加标的模拟尿、接触者混合尿或加标的正常人混合尿作质控样。中华人民共和国卫生部1996-10-14批准1997-05-01实施 WS/T 56--19965采样、运输和保存使用硬质玻璃瓶，收集接触苯胺工人的班末或班后2h内的尿。尽快测定比重后，按100mL尿样4～5滴的比例加入盐酸（4.2），4℃下可保存4天。6分析步骤6.1仪器操作条件色谱柱：柱长25cm，内径4.6mm，不锈钢柱。柱填料：反相C1键合固定相，5μum。柱温：50℃。流动相：甲醇+水=30+70(V/V）。流速：1.0mL/min。检测器波长：254nm。6.2空白试验取2mL正常人混合尿样与样品同时测定。6.3样品处理6.3.1取2mL尿样于25mL试管中，加1mL水，1mL盐酸（4.2），摇匀，加盖。6.3.2放在沸水浴中加热1h，取出冷至室温，加水补足体积至4mL。加5mL乙酸乙酯萃取尿中部分干扰物质，再加5mL乙酸乙酯重复萃取一次，弃掉有机相。于水相中加入4g磷酸氢二钾，摇匀。加入5mL乙酸乙酯萃取对氨基酚。静置分层，轻轻摇动，使萃取液中的棕色悬浮物下沉。上清液供分析用。6.4标准曲线的绘制6.4.1取4支25mL试管，按下表配制标准管。对氨基酚标准管的配制管号1234正常人混合尿，mL2. 02. 02. 02. 0对氨基酚标准溶液（4.7)，mL00. 10. 5 1. 0水,mL1. 00. 9 0. 50相当于尿中对氨基酚浓度04. 020. 040.0μg/mL6.4.2以下操作按6.3.2条进行。6.4.3取10μL萃取物上清液进高效液相色谱仪，按操作条件（6.1)测定。重复进样三次。6.4.4以对氨基酚浓度为横坐标，各浓度对应的峰高平均值为纵坐标，绘制标准曲线。6.5样品测定6.5.1取10uL样品及空白样萃取物的上清液（6.3、6.2)分别注入高效液相色谱仪中，按操作条件(6.1)测定。6.5.2用保留时间定性，峰高定量。对氨基酚色谱图见下图。在测定前后以及每测定10个样品后，测定一次质控样。 WS/T56-1996PAP78时间，min尿中对氨基酚的液相色谱图7 计算7.1按式(1)计算尿样换算成标准比重(1.020)下的浓度校正系数(k)。1.020 -1.000k=(1)实测比重－1.0007.2按式(2)计算尿中对氨基酚的浓度。Xc·k(2)式中：X一尿中对氨基酚的浓度，mg/L；一由标准曲线查得的对氨基酚的浓度,mg/L。8说明8.1本法的最低检测浓度为0.5mg/L（空白值的3倍标准差）；测量范围为0～20mg/L（乙酸乙酯萃取后的浓度）；当尿中对氨基酚浓度为4.0～40.0mg/L时，变异系数分别为CV=3.7%~6.9%；尿中对氨基酚浓度为3.0~10.7mg/1.时，加标回收率为95.0%~103.8%。8.2苯胺在体内的代谢速度快，所以要在班末或班后2h内采样，以正确地反映接触剂量。采样后应尽早加酸，低温保存。8.3尿中对氨基酚部分以结合态存在，为测得对氨基酚总浓度,须将结合态对氨基酚水解。尿样加酸后，于沸水浴中加热1h，可完全水解。8.4水解后的尿样中有一未知组分，在中性条件下能与对氨基酚一起被萃取出来，干扰测定。因此必须先在酸性条件下，用乙酸乙酯预萃取，除掉干扰物。然后再于中性条件下萃取对氨基酚。预萃取过