SN 1675-2005鱼真鲷虹彩病毒聚合酶链反应操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1675—2005鱼真鲷虹彩病毒聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction (PCR) forred sea-bream iridovirus (RSIV) of fish2005-09-30 发布2006-05-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1675--2005前本标准的附录 A为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘、范万红、罗卫、黄逊、吕建强、秦智锋本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1675—2005鱼真鲷虹彩病毒聚合酶链反应操作规程1 范围本标准规定了用聚合酶链式反应技术检测鱼真鲷虹彩病毒的方法。本标准适用于鱼真鲷虹彩病毒的检测及鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696:1987）GB/T18088--2000出人境动物检疫采样3试剂和材料除特别说明外，本标准使用试剂均为分析纯。3.1水：应符合 GB/T 6682--1992中-级水的规格。3.2Tag酶:5 U/μI，一20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。3.3 dNTP:含 dCTP,dGTP、dATP,dTTP 各 10 mmoL/L。3.4引物：浓度为40μmol/I。其序列如下：RSIV-F:5-GTG ACT GCA CAC CAA TGGAC-3RSIV-R: 5-GGC TTT CTC AAT CAG CTTGC-33.5无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。3.6矿物油：使用无热盖的 PCR仪时使用，要求无 DNA酶。3. 7核酸分子量标准参照物。3.8溴代十六烷基二甲胺(CTAB)。3. 9溴化乙锭(EB)。3. 10酚。3. 11三氯甲烷。3. 12异戊醇。3. 13巯基乙醇。3.14三羟甲基氨基甲烷(Tris）。3. 15硼酸。3. 16乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。3. 17溴酚蓝。3. 18蔗糖。3. 19盐酸。4 器材和设备4. 1PCR扩增仪。 SN/T 1675—20054.2电泳仪。4.3微量移液器及吸头。4.4紫外观察灯。4.5恒温培养箱。4.6普通冰箱和低温冰箱。4.7 匀浆器。4.8离心机和离心管。4.9 制冰机。5取样和制样5.1 取样对鱼的解剖采样，如果是体长小于 4 cm 的鱼苗取整条鱼，体长 4 cm～6 cm 的鱼苗取内脏（包括肾）;体长大于 6 cm 的鱼则取脑、肝、肾、脾。成熟雌鱼还需取卵巢液。而鱼的采样数量按 GB 18088一2000的规定采样。5. 2 制样在15℃条件下,在 1.5 mL Eppendorf 管中首先加人 25 mg～100 mg 组织,加人 150 μL CTAB溶液（见第 A，1章），用小剪刀剪碎，然后用匀浆器将样品均浆成糊状。再加CTAB溶液到800uL。混匀后置于 25℃作用 2 h。6RSIV 核酸的鉴定6.1 核酸抽提首先加350μL抽提液1（见第A.2章），充分混合至少30s;12000r/min离心5min，取上层水相；再加350μlL抽提液2（见第A.3章），充分混合30s；12000r/min离心5min，取上层水相；然后加人1.5倍体积的一20℃无水乙醇，混匀后，一20℃放置6h以上；15000r/min离心30min*小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸于液体，37℃干燥 20 min或抽真空干燥；最后加10μL水溶解后，作为 PCR模板。6. 2 PCR 扩增反应体系为 100 μL:水 62 μL、dNTP 2 μL、上游引物和下游引物各 2.5 μL、25 mmoL/L的 MgCl2（见第 A.4章)10 μL、10倍 Taq酶浓缩缓冲液（见第 A,5章）10 μL、模板10 μL、Tag酶1 μL。如使用无热盖的PCR扩增仪，需在反应混合物上覆加50μI矿物油。混勾后低速离心，让矿物油在上层。再将反应管置于 PCR扩增仪。94℃变性4 min;94℃变性1 min、58℃退火1 min、72℃延伸1 min,35次循环;72℃延伸10 min;4℃保温。6.3设立对照6.3.1在6.1中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。6.3.2取含有已知 RSIV 的病