SN_T 3567.3-2015交叉引物恒温扩增检测方法 第3部分：大肠杆菌O157:H7.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3567.3—2015交叉引物恒温扩增检测方法第 3 部分：大肠杆菌 0157:H7Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part 3:Escherichia coli 0157 :H72016-07-01实施2015-12-04 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局层查真伙 SN/T 3567.3-2015前言SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为以下几个部分：第1部分：通用技术规程；第2部分：霍乱弧菌；第3部分：大肠杆菌0157：H7；第4部分：黄热病毒；一——第5部分：沙门菌属；—第6部分：结核分枝杆菌；....本部分为SN/T3567的第3部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、杭州优思达生物技术有限公司本部分主要起草人：祁军、盛鸿颖、周艳容、王馨、尤其敏、胡林。I SN/T 3567.3—2015交叉引物恒温扩增检测方法第3部分：大肠杆菌0157:H71 范围SN/T3567的本部分规定了在国境口岸利用交叉引物恒温扩增法检测大肠杆菌O157：H7的生物安全措施、检测对象、试剂和材料，仪器设备及检测程序。本部分适用于在国境口岸对大肠杆菌0157:H7菌株的快速筛选检测。22规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.6食品卫生微生物学检验，致泻大肠埃希氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB17012感染性腹泻的诊断标准及处理原则GB 19489实验室生物安通用要求SNT 2754.2出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第2部分：大肠杆菌0157:H7SN/T 3567.1交叉引物恒温扩增检测方法：复第1部分：通用技术规程人间传染的病原微生物名录2006）3术语和定义SN/T3567.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件3.1大肠杆菌0157:H7Escherichia coli0157:H7大肠埃希菌的一种特殊血清型，能引起人类的出血性腹泻和肠炎，且并发溶血性尿毒症、血小板减少性紫癜等。严重时可致人死亡。4生物安全措施实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定，由具备相关资质的工作人员进行。5检测对象5.1疑似大肠杆菌O157：H7的待检菌株。5.2肠道出血性大肠杆菌感染病例或疑似肠道出血性大肠杆菌感染者的粪便、血液及其增菌液 SN/T3567.3-—20156试剂和材料除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，包括：按照GB/T6682规定的一级水。-DNA提取液：5%Chelex水溶液。-10×ThermoPol缓冲液。-10mmol/LdNTPs溶液：dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L。-Bst DNA 聚合酶：8 U/μL。-甜菜碱溶液：5mol/L。硫酸镁溶液：1mol/L。引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。1仪器设备所用仪器设备如下：任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪。微量移液器：量程范围为0.5μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL。计时器。超净工作台。生物安全柜。消毒灭菌锅。高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。台式离心机（最高离心力2000g以上）。涡旋振荡器。低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。8检测程序8.1样本标识样本应进行唯一性标识。8.2样本采集、细菌增菌及分离鉴定按照GB17012、GB/T4789.6和SN/T2754.2执行。8.3样本前处理8.3.1大肠杆菌0157：H7疑似菌株科玛嘉平板上纯培养物用无菌接种环挑取1/4～1个菌落，混悬于100μL灭菌或无菌双蒸水或纯水中。LST肉汤或EC肉汤中的纯培养物取增菌液1mL加到1.5mL离心管中，以7000g离心2min集菌，弃去上清液取沉淀物。2 SN/T3567.3—20158.3.2粪便样本直接从粪便样本中提取模板时，选取有脓血、黏液部分的成形便3g～5g，水样便取含絮状物的1mL～3mL，加人6mLpH7.4PBS混匀，500g离心5min10min，收集上清液于1.5mL离心管中，此步骤重复3次，上清液5000g离心10min，弃去上清液，沉淀物在1mL双蒸水（ddHzO）中