SNT 2485-2010植物病毒脱除处理规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2485-2010植物病毒脱除处理规程Rules of plant virus elimination2010-03-02发布2010-09-16实施1001970151变询真保中华人民共和国数码防伪发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2485--2010前言本标准附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准参与起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局，华中农业大学，天赐花卉公司。本标准主要起草人：李明福、王仁睿、黄新、王国平、丁元明、潘利军、马洁，本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2485—2010植物病毒脱除处理规程1范围本标准规定了植物脱毒处理程序方法。本标准适用于检验检疫行业、农林业对带有病毒的植物繁殖材料的无毒无害化处理。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准2. 1病毒virus病毒是肉眼不可见，依赖于寄主细胞复制,箕基因组核酸外包裹着外壳蛋白的一类专性寄生的特殊微生物。2.2病毒脱除处理virus eliminati应用物理、化学、生物学等方法，祛除植物所感染的病毒，使之无毒无害化的过程。2.3组织培养 plant tissue culture在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、乡及原生质体殖材料，培养在人工培养基上，并在人工控制的环境下生长、分化、增殖至再挂植株的过程。2. 4茎尖培养‧shoot apices culture1在无菌条件下剥取植物茎类（顶端分生组织带1~2个幼叶原基），在人工控制的条件下分化再生的方法。2.5热处理thermotherapy植物材料置于适当的隔离设施(如：恒温恒湿箱、日光温室)中,在不同的高温条件下，持续处理一定的时间（几周或数月），以钝化植物中的病毒或降低其浓度。2.6化学处理chemotherapy在植物培养基中添加一定浓度的化学物质,抑制或干扰植物组织中的病毒复制或繁殖。3原理3.1处理原则针对检验检疫或生产中发现植物携带管制的病毒时，一般可进行销毁处理。如因植物珍贵或应客户需求，需针对管制的病毒实施脱除处理。3.2病毒脱除处理针对植物病毒在植物体内分布不均匀、植物病毒复制过程需要特殊酶或物质参与，植物病毒外壳蛋白受热钝化等特点，设计茎尖组织培养、化学治疗和物理治疗，以脱去病毒。1 SN/T 2485---20104仪器和用具4.1仪器4.1.1超净工作台。4. 1.2 天平(0. 001 g)。4.1.3解剖镜。4.1.4光照培养箱。4.1.5恒温恒湿箱。4.1.6高温灭菌锅。4.2　用具4.2.1 量筒。4.2.2容量瓶。4.2.3接种针或解剖刀。4.2.4镊子。4.2.5pH 计或 pH 试纸。5病毒检测方法5.1生物学检测（指示植物法）。5.2酶联免疫法。5.3 RT-PCR方法。5.4核酸杂交方法。6植物病毒脱除处理程序6.1 病毒脱除方法6.1.1材料剪取与灭菌在超净工作台上剪取植株茎尖1cm～2 cm，自来水冲洗 30 min,剥去外面的叶片,将茎尖置于超净工作台上，无菌条件下进行消毒：75%的乙醇浸泡10s，已灭菌的蒸馏水冲洗3次～5次，0.1%的升汞浸泡,加入 1滴～2滴吐温，消毒 5 min～15 min,已灭菌的蒸馏水冲洗 3次～5次，每次 2 min～3 min。6. 1.2茎尖剥离与接种把经过上一步消毒处理后的茎尖放在解剖镜下，用已灭菌的接种针或解剖刀逐层剥去幼叶，直至出现顶端分生组织,将顶端分生组织和毗邻的1个～2个叶原基切下，直立向上接种到适宜的固体培养基上。6.1.3热处理结合茎尖培养将供试材料放人恒温恒湿箱（温度范围：30℃～40℃），日夜变温处理几天至几月。热处理后的材料按照上述茎尖剥离与接种步骤进行培养，参见附录A。6.1.4化学治疗结合茎尖培养筛选对病毒有抑制作用的化学药剂,如病毒唑、硫脲嘧啶等,浓度常为 10 mg/L～30 mg/L,添加到培养基中,培养一月至几月，然后再按照上述茎尖剥离与接种步骤进行培养,参见附录A。6.2试管苗的病毒检测用上述病毒的检测方法检测试管苗，如果检测结果为阴性则初步定为脱病毒试管苗，进行后期的扩繁和生根移栽，如果检测结果为阳性则不是脱病毒试管苗，需要进一步进行病毒脱除处理。2 SN/T 2485—20106.3试管苗的扩繁与生根培养6.3.1试管苗的扩繁检测结果为阴性的试管苗可接种到扩繁培养基上进行增殖。6.3.2生根培养试管苗长至 3 cm～5 cm 时转至生根培养基进行培养。6.4试管苗的驯化将生长苗壮、有3片～5片叶的试管苗移至温室进行炼苗。6.5移栽6.5.1过渡培养取出试管苗,洗净根部培养基,移人适宜的栽培基质中,刚移栽的试管苗要避光，湿度：