SN_T 3567.1-2013交叉引物恒温扩增检测方法 第1部分：通用技术规程.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3567.1—2013交叉引物恒温扩增检测方法第1部分：通用技术规程Detection method of crossing priming isothermal amplification--Part 1 :General technical regulation2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国0发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T3567.1~2013前言本部分为SN/T3567的第1部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本部分主要起草人：祁军、张霞、王馨、刘振宇、左锋、柴宏森、詹曦菁、魏永新、李智慧、尤其敏、胡林、崔景柏。 SN/T 3567.1—2013交叉引物恒温扩增检测方法第1部分：通用技术规程1 范围SN/T3567的本部分规定了交叉引物恒温扩增技术平台建立时引物设计、所需材料及仪器、扩增体系建立和扩增产物检测的具体内容以及各步骤的操作规范本部分适用于检验检疫机构建立交叉引物恒温扩增技术，并基于该技术应用于有害以及病原微生物的快速鉴定和检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所存的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1恒温扩增技术isothermalahplificationtechnology一类核酸扩增方法，其扩增反应的全过程均在单一温度、无需专门的扩增仪器下进行。与聚合酶链式反应（polymerase chain reactio，PCR)不同，它不需要经历十个温度变化的循环过程。3.2交叉引物恒温扩增技术cross priming isothermal amplification;CPA一种核酸恒温扩增技术，CPA扩增体系中除包含具有链置换功能的DNA聚合酶（DNApolymerase)外，还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）的循环扩增能不断地实现。3.3交叉引物 cross primer用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引入对方的杂交序列，增加引物的杂交位点，促进扩增反应。3.4剥离引物bomperprimer位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸链从模板上剥离。1 SN/T 3567.1—20133.5检测引物detectionprimer-对位于交叉引物内侧的短链引物，需要用半抗原或荧光素标记，其作用是使扩增产物带有该标记，以用于检测。3.6Bst DNA 聚合酶 Bst DNA polymerase嗜热脂肪芽孢杆菌（BacillusStearothermophilus）DNA聚合酶的部分片段，保留了其5-→3DNA聚合酶活性，但是去除了5-3核酸外切酶活性。BstDNA聚合酶最主要的特性是具有超强的链置换功能（stranddisplacement)。3.7半抗原hapten用于标记检测引物的化学物质，它们与相应的抗体特异性地结合，用于检测扩增产物。常见的半抗原如些荧光染料（利用其抗原性而非荧光性)或生物紫（biotin)等。用于本部分的半抗原为荧光染料FITC和生物素，分别标记在一对检测引物的5’末端。扩增产物则带有该半抗原标记.然后利用免疫层析显色原理与包被有相应抗体的核酸检测试纸条相结合进行显色，从而完成扩增产物的检测。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，按照GB19489中的有关规定，应由具备相关资格的工作人员进行实验操作。所有废弃物也应按照GB19489中的有关规定执行。5原理5.1基于DNA的扩增交叉引物恒温扩增技术的特点是针对靶基因区域内设计六条（三对)特异引物，引物尾端交叉互换序列，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下完成DVA扩增反应，其操作步骤和反应机理简述如下：一设计一对交叉扩增引物和一对剥离引物；一在扩增靶核酸序列的两端引人交叉引物杂交位点；一-以线性结构和/或二级结构的方式进行扩增，通过引物的反复杂交、延伸和扩增产物的自我杂交折叠及延伸，产生多个引物杂交位点，使同一条模板上可有多个扩增反应同时进行