SN_T 2797-2011食品中致泻大肠埃希氏菌检测 MPCR-DHPLC法.pdf

5中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2797—2011食品中致泻大肠埃希氏菌检测MPCR-DHPLC 法Detection of diarrheagenic Escherichia coli in food--MPCR-DHPLC method2011-07-01 实施2011-02-25 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局物 SN/T 2797—2011前言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国西藏出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：徐君怡、曹际娟、郑秋月、王顺芝、高小博、李苏龙、李建民、王秋艳、赤列加措。 SN/T 2797—2011食品中致泻大肠埃希氏菌检测MPCR-DHPLC 法1 范围本标准规定了食品中致泻性大肠埃希氏菌，包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌的 MPCR-DHPLC 检测方法。本标准适用于食品中致泻性大肠埃希氏菌,包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌的 MPCR-DHPLC 快速检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室　生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T 0973进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌O157:H7检验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR(polymerase chain reaction):聚合酶链式反应MPCR(multiplex PCR):多重 PCRDHPLC(denaturing high pererformance liquid chromatography）：变性高效液相色谱TEAA：三乙基铵乙酸盐4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB19489的有关规定执行。5废弃物处理和防止污染的措施5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30 min后再弃置。5.2检测过程中防止交叉污染的措施参照标准GB/T27403的规定执行。6原理多重 PCR，又称多重引物 PCR或复合 PCR,它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时 SN/T 2797—2011扩增出多个核酸片段的 PCR反应,其反应原理，反应试剂和操作过程与一般 PCR 相同。DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺乙酸盐缓冲溶液（TEAA），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引,同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C1:表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引,通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。7 试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯,水为灭菌超纯水。所有试剂均用无 DNA酶污染的容器分装。7.1水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。7.2Taq DNA 聚合酶。7.3dNTP:dATP、dTTP.dCTP、dGTP。7.4　10×PCR缓冲液:见 A.1.1。7.5引物：引物序列见表A.1。7.6TE溶液:见 A.1.2。7.710% SDS.7.8蛋白酶 K(20 mg/mL)。7.9氯化钠溶液(NaCl):5 mol/L 和 0.7 mol/L。7.10 10% CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)。7.11三氯甲烷。7.12 异戊醇。7.13 酚。7.14 异丙醇。7.15 70%乙醇。7.16 DHPLC缓冲液:见 A.1.3。7.17双料缓冲蛋白陈水：见 A.1.4。8主要仪器和设备8.1 PCR 仪。8.2 DHPLC 仪。8.3离心机(离心转速18 000g)。8.4　PCR 超净工作台。8.5微量可调移液器和灭菌吸头:2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL。8.6灭菌 PCR反应管。9方法提要与检测程序9.1方法提要本方法采用四重 PCR同时扩增四种致泻性大肠埃希氏菌。四重 PCR 产物再利用 DHPLC非变性条件下的DNA分离技术，根据DNA扩增片段长度的不同，按照从小到大顺序依次洗脱核苷酸片段，从2 SN/T 2797—2011而对食品中致泻性大肠埃希氏菌进