SN_T 2976-2011鲑鱼立克次氏体检疫技术规范 巢式聚合酶链式反应法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2976-2011鲑鱼立克次氏体检疫技术规范巢式聚合酶链式反应法Quarantine protocol for piscirickettsia salmonis by nestedpolymerase chain reaction2012-04-01实施2011-09-09 发布中华人民共和国骨发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪， SN/T 2976—2011言前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准与国际动物卫生组织（OIE)《水生动物疾病诊断手册》（2006年版）第2.1.13章一致性程度为非等效。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：谢明星、彭小莉、刘棠、陈双雅、刘、贾鹏、张利峰、陈伟玲、王群力、王景明。 SN/T 2976—2011鲑鱼立克次氏体检疫技术规范巢式聚合酶链式反应法1范围本标准规定了鱼立克次氏体巢式聚合酶链式反应检测方法。本标准适用于鲑鱼立克次氏体检疫B2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。bp(base pair):碱基对DNA(deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleosidtriphosphate):脱氧核苷兰磷酸EDTA(ethylene diaminetetraacetic-acid)乙二胺四乙酸action）！巢式聚合酶链式反应Nested-PCR(nested polyrherase Chain烷基硫酸钠SDS(sodium dodecyl sulfhte) :Taq(Thermus aquaticu）:水生热栖菌TE:Tris-CI、EDTA 缓冲液Tris[tris(hydroxymethyl)aminomethane];三(羟甲基)氨基甲烷设备和试剂44.1设备一20℃低温冰箱。4.1.1组织匀浆器。4. 高速冷冻离心机。4.1.4生物安全柜。4.1.5生化培养箱。4.1.6 PCR 仪。电泳仪。4.1.7凝胶成像仪或紫外观察灯。4.1.81 SN/T 2976—20114.2试剂4.2.1双蒸水应符合 GB/T 6682中一级水规格。4.2.2琼脂糖(电泳纯）。4.2.3鲑鱼立克次氏体参考毒株。4.2.4Taq酶:5U/μL。一20℃保存,避免反复冻融或温度剧烈变化。4.2.5DNA 相对分子质量标准(DNA Marker):100 bp～1000 bp。4.2.6溴化乙锭溶液（10 μg/μL）：见附录 A。4.2.7TE(Tris-HCI、EDTA)缓冲液、10XPCR缓冲液、电泳缓冲液和电泳样品缓冲液：见附录 A。5巢式聚合酶链式反应(nested-PCR)5.1采样适用于本病检测的是临床感染的鱼，体长≤4cm的幼鱼取整条鱼，体长 4cm～6 cm 及以上的鱼则取皮肤溃疡部位和出现病变的肾、脾、肝、胃、、肌肉和脑组织等。无临床症状的鱼（外表健康的鱼）：肝、肾、脾和小肠。可将不超过5条鱼的组织混合在一起。最佳的目标组织是肝、肾、脾及小肠。5.2核酸的抽提用经典的酚-三氯甲烷萃取法（见附录B)或商业化DNA提取试剂盒。5.3引物的设计外部引物序列如下：EubB(27F) : 5-AGA-GTT-TGA-TCM-TGG-CTC-AG-3EubA(1518R) : 5′-AAG-GAG-GTG-ATC-CAN-CCR-CA-3内部引物序列如下：PS2S(223F) : 5-CTA-GGA-GAT-GAG-CCC-GCC-GCG-TTG-3 PS2AS(690R) : 5°′-GCT-ACA-CCT-GAA-ATT-CCA-CTT-3内部引物可以特异性的扩增出468bp大小的鲑鱼立克次氏体16SrDNA片段。5.4　PCR 扩增体系PCR扩增在标准的 20 μL的反应体系中进行，包括 1×PCR 缓冲液，1.5 mmol/L 氯化镁，200 μmol/L 的 dNTPs、10 μmol/L引物各0.5μL,1.6 U 的 Taq DNA 聚合酶和 100 ng DNA 模板。内部引物扩增反应的模板用0.2μL外部引物的扩增反应产物。5.5PCR 反应条件外部引物扩增反应程序是：94℃预变性5min，94℃1min，50℃2min和72℃3min循环35次，最后 72℃ 10 min。内部引物扩增反