SN_T 4613-2016国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4613--2016国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法Real-time RT-PCR method for Kunjin virus detection at frontier ports2016-08-23发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局电话4005921刮涂层查真伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法SN/T 4613-2016*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045)总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12301/16印张 0,5字数 10 千字2018年1月第一版2018年1月第一次印刷印数 1—500*书号：155066·2-32346 SN/T 4613—2016前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、河北国际旅行卫生保健中心。本标准主要起草人：孙肖红、刘键、闫冀焕、徐宝梁、马雪征、张丽萍、白红岩。上 SN/T 4613—2016国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了昆津病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理和荧光RTPCR 检测。本标准适用于昆津病毒的荧光RT-PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部卫科教发[2006]15号】3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1昆津病毒Kunjin virus;KUNV也可译为“库京病毒”,属于黄病毒科黄病毒属成员，于1960 年在澳大利亚的环喙库蚊（Cule annulirostris）中首次分离。除了环喙库蚊以外，伪杂鳞库蚊（Culer pseudovishnui）、致倦库蚊（Culerquinquefasciatus）、澳大利亚库蚊（Culer australicus）和鳞状库蚊（Culer suamosus）等也可传播该病毒。病毒的主要宿主是鸟类、家禽、猪、牛、马。水鸟可以将病毒传播至远方，而猪、牛、马又可起到放大宿主的作用。昆津病毒病是一种人畜共患病，主要流行于澳大利亚，人类感染后主要表现为发热、头痛、肌肉痛,严重者可以发展为脑炎。4缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct 值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数；FAMFAM荧光染料，一种荧光报告基团;RNA核糖核酸;RT-PCR反转录-聚合酶链反应。5生物安全要求《人间传染的病原微生物名录》规定，昆津病毒的未经培养的感染性物质、灭活材料的操作应在不同级别生物安全实验室进行，具体如下：1 SN/T 4613-2016昆津病毒相关的感染性材料的操作应在生物安全二级（BSL-2或ABSL-2)实验室内进行；一昆津病毒相关的灭活材料在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行；昆津病毒感染性材料运输包装分类为B类，UN编号为UN3373。6　标本的采集、运输和保存6.1 人血清标本无菌采集可疑病人的静脉血3mL～5mL，室温静置30min，然后500g离心10min，收集上清（血清)于2mL螺口塑料管内，用耐低温油性记号笔记上编号，4℃以下送检。不能及时检测的标本应保存于－70℃或以下温度。6.2蚊虫根据实际工作需要采集蚊虫样品。将采集的蚊虫直接放人一20℃冰箱冻死后，取出，分类编号，按30只～50只一份，装人2mL螺口塑料管内，用耐低温油性记号笔记上编号，干冰或液氮运输，或一70℃以下保存待检。7 标本的处理7.1人血清标本血清标本可直接提取核酸。7.2蚊虫7.2.1从一70℃容器中取出蚊虫标本,倒人研磨器中。7.2.2加入 1 mL PBS或生理盐水吹洗，弃去液体后加人1 mL PBS或生理盐水，反复研磨至组织碎片基本消失。7.2.3将研磨液吸人1.5mL离心管，配平后置预冷4℃的离心机上，20000g离心10min。7.2.4取上清液提取核酸。8荧光 RT-PCR 检测8.1主要仪器需要以下仪器：-荧光定量 PCR仪；一超净工作台；生物安全柜；高压灭菌锅;一-低温高速离心机：最大离心力20000g；漩涡振荡器;1—冰箱:4℃、—20℃和－70℃;-移液器:10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和 1 mL。2 SN/T 4613—20168.2主要试剂8.2.1核酸提取试剂: