SN_T 2562-2010食品中霍乱弧菌分群检测 MPCR-DHPLC法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2562—2010食品中霍乱弧菌分群检测MPCR-DHPLC 法Grouping detection of Vibrio cholerae in food-MPCR-DHPLC2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2562—2010前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国西藏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郑秋月、曹际娟、邵碧英、赵昕、郑晶、黄晓蓉、刘冉、徐君怡、王秋艳、李建民、耿丽梅、于畅。 SN/T 2562—2010食品中霍乱弧菌分群检测MPCR-DHPLC 法范围本标准规定了食品中霍乱弧菌，包括01群、O139群和非O1/非O139群霍乱弧菌的MPCR-DHPLC分群检测方法。本标准适用于食品中霍乱弧菌，包括01群、0139群和非01/非O139群霍乱弧菌的MPCR-DHPLC快速分群检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验SN/T1022出口食品中霍乱弧菌检验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。3. 1PCR polymerase chain reaction聚合酶链式反应。3.2MPCR multiplex PCR多重 PCR。3. 3DHPLCdenaturing high performance liquid chromatography变性高效液相色谱。3.4TEAA三乙基铵乙酸盐。生物安全措施7为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB19489的有关规定执行。 SN/T2562—20105废弃物处理和防止污染的措施5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。5.2检测过程中防止交叉污染的措施按GB/T27403规定执行。6原理MPCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系单加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般 PCR相同。DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺乙酸盐缓冲溶液（TEAA），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。7试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。7.1 Taq DNA.聚合酶。7.2dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。7.310XPCR缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),200 mmol/L氯化钾(KCl),15 mmol/L氯化镁(MgCl²)。7.4引物：引物序列见附录A表A.1。7.5 TE溶液。7.6 10% SDS.7.7至蛋白酶K(20mg/mL）。7.8氯化钠溶液(NaCI)：5mol/L和0.7mol/L。7.9 10% CTAB7. 10三氯甲烷。7.11异戊醇。7. 12酚。7.13异丙醇。7.1470%乙醇。7.15DHPLC缓冲液：缓冲溶液A为50mLTEAA和250μL乙腈混合，加水定容至1000mL；缓冲溶液B为50mLTEAA和250mL乙腈混合，加水定容至1000mL；缓冲溶液D为75.%乙睛。8:主要仪器和设备8.1 PCR仪。8.2 DHPLC 仪。8.3高速离心机：离心转速18000g。8.4·PCR超净工作台。2 SN/T2562—20108.5微量可调移液器和灭菌吸头：2μL，10uL，100μL，200uL，1000μL。8.6灭菌 PCR反应管。9方法提要与检测程序9.1方法提要本方法采用MPCR同时扩增霍乱弧菌及其三个血清群（O1群、O139群和非O1/非O139群）。MPCR产物再利用DHPLC非变性条件下的DNA分离技术，根据DNA扩增片段长度的不同，按照从小到大顺序依次洗脱核苷酸片段，从而实现对食品中霍乱弧菌进行快速分群检测。9.2检测程序MPCR-DHPLC分群检测食品中霍