SN_T 2055-2016豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2055-2016代替SN/T2055—2008豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Cowpea severe mosaic virus2016-08-23发布2017-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局商件 SN/T 2055--2016前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准代替SN/T2055--2008《豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法》，与SN/T2055-2008相比，主要变化如下：增加了常规RT-PCR检测方法；-增加了实时荧光RT-PCR检测方法本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李桂芬、孔君、李彬、马洁、陈青、魏梅生、张永江。本标准所代替标准的历次发布情况为：SN/T 2055--2008。I SN/T2055—2016豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法。本标准适用于豆科繁殖材料（种子、植株）中豇豆重花叶病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3基本信息学名：Cowpea severe mosaicvirus缩写：CPSMV分类地位：伴生豇豆病毒科（Secoviridae），虹豆花叶病毒亚科（Comovirinae），豇豆花叶病毒属(Comovirus)。该病毒的其他信息参见附录A。4方法原理根据豇豆重花叶病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行ELISA检测：根据该病毒核酸的序列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定；根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过检测的荧光信号进行结果判定。5仪器设备及试剂5.1仪器设备酶标仪、天平（感量，1/10000g）、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器（2μl，10μL,20μL，100μL200μL，1000μL）、酶联板、研钵、离心管、花盆、消毒土等。5.2试剂酶联免疫吸附测定试剂见附录B的B.1、RT-PCR检测试剂见附录C的C.1、实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D的D.1。试验用水应符合GB/T6682要求。6样品制备6.1种子挑取畸形、不成熟种子及随机挑选的种子播于灭菌土中，待长出幼叶后，将表现症状的植株单独编 SN/T2055-2016号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子检测。6.2植株有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等)的植株编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法和检测方法同6.1。7检测方法7.1酶联免疫吸附测定见附录B。7.2RT-PCR检测方法见附录C。7.3实时荧光RT-PCR检测方法见附录D。7.4生物学测定见附录E。8结果判定样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行：先用DAS-ELISA方法进行检测。若DAS-ELISA结果为阴性时，RT-PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带CPSMV；检测结果为阳性，则对产物进行测序，测定的序列为CPSMV序列，则判定样品携带CPSMV或用实时荧光RT-PCR进行检测，若检测结果为阴性，则判定样品不携带CPSMV；若检测结果为阳性，则判定样品携带CPSMV若DAS-ELISA结果为阳性时，RT-PCR检测或实时荧光RT-PCR检测为阳性，即可判定待检样品携带CPSMV。9样品保存与结果记录9.1样品保存经检测确定携带豇豆重花叶病毒的样品应在合适的条件下保存，种子在室温干燥保存1年；植株一80℃保存1年，做好标记和登记工作。9.2结果记录完整的记录包括：样品的来源、时间、地点、方法和结果等并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测需要有反应原始数据，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。2 SN/T2055—2016附录A（资料性附录）豆重花叶病毒背景资料A.1寄主范围A.1.1自然寄主毛蔓豆（Calopogoniummucunoides），直生刀豆（Canavaliaensiformis），距瓣豆（Centrosemapumar），大翼豆（Macroptiliumbescens），麻（Crotalariajuncea），Desmodi