SN_T 4734-2016雪松疫霉根腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4734—2016雪松疫霉根腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phytophthora lateralis Tucker et Mibrath2016-12-12 发布2017-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4734—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国昆山出人境检验检疫局、南京农业大学、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：纪睿、张正光、廖太林、李百胜、王建生、安榆林、吴翠萍。I SN/T4734—2016雪松疫霉根腐病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了雪松疫霉根腐病菌（PhytophthoralateralisTuckerMilbrath）的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境苗木、原木、木材、木质包装等植物材料及其土壤和介质中雪松疫霉根腐病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3雪松疫霉根腐病菌基本信息学名：Phytophthoralateralis TuckerMilbrath分类地位：藻菌界（Chromista），卵菌门（Oomycota），霜霉目（Peronosporales），腐霉科（Pythiaceae），疫霉属（Phytophthora）。雪松疫囊根腐病菌的其他信息参见附录A4方法原理在病原菌分离培养的基础上，对分离的病菌在形态上进行分析以及进行巢式PCR检测，通过电泳条带大小进行结果判定。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、台式小型离心机、常规冰箱、涡旋振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统。5.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯和生化级试剂。实验用水为超纯水，规格符合GB/T6682相关规定。V8汁、碳酸钙、琼脂粉、青霉素、利福霉素、五氯硝基苯、溴化十六烷基三甲铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、无水乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、醋酸钠、RNase、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、PCR缓冲液、氯化镁、dNTPs（含dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、TagDNA聚合酶、弓I物T1/T2、引物T3/T4、DL2000标记物、电泳缓冲液、琼脂糖、溴化乙锭（EB）。1 SN/T4734—20166病菌的鉴定6.1症状检查按照SN/T2122相关规定抽取苗木、原木或木材，仔细观察其枝叶是否变色（呈黄至深褐色）、枯菱、易脱落；根部是否有湿腐症状；用斧子、锯子或刀片分别横向、纵向切开，仔细观察树干形成层是否变色（呈褐色）、具有一条清晰的黑色树脂线，取有疑似症状的植物部分，样品采集后注意保湿。收集被携带进境的土壤和介质，带回实验室作进一步检验。6.2病原菌的分离培养和诱集6.2.1培养基的制备培养基的制备参见附录B。6.2.2分离培养取病健交界处和病斑中部的植物组织，将其表面用自来水冲洗干净，置于吸水纸上晾干。将病组织切成2mm×2mm左右大小，置于选择性培养基上，20℃黑暗培养7d～14d，待选择性培养基平板上的病组织块四周长出真菌菌落后，切取菌丝块转到V8培养基上，20℃12h光照/12h黑暗培养7d~14d，待长出菌落后，切取菌丝块置于10%V8培养液中，20℃光照培养4d～6d，过滤收集菌丝，经冷冻抽干研磨成粉，一20℃保存备用。6.2.3土壤和介质的诱集将土壤或介质置于培养皿中，加人灭菌水，充分搅匀，静置数小时，待土壤沉淀后，取美国扁柏（Chamaecyparislazusoniana）等寄主植物（参见附录A）的材料，灭菌水清洗后漂放在水面上，在2o℃下诱集，待植物材料发病后采用组织分离法进行分离培养（同6.2.2）。6.3病原菌形态特征观察将分离培养后得到的病菌菌株，置于显微镜下观察其菌丝、孢子囊等形态特征。病菌形态特征参见附录A。6.4巢式PCR凝胶电泳检测巢式PCR凝胶电泳检测见附录C。7结果判定若分离培养后得到的病菌菌株的形态特征与描述的部分相符，可初步判定为检出雪松疫霉根腐病菌，需利用6.4方法进一步检测。若巢式PCR凝胶电泳检测为阳性，而且扩增片段大小与描述相符可判定为雪松疫霉根腐病菌。8样品保存8.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检山雪松疫霉根