SN_T 3965-2014桃色欧文氏菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3965—2014桃色欧文氏菌检疫鉴定方法Detection and identification of Erwinia persicina Hao et al.2014-11-01实施2014-04-09发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准桃色欧文氏菌检疫鉴定方法SN/T 3965-2014*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12301/16印张0.755字数 15千字2014年12月第一版2014年12月第一次印刷印数 1—1300*书号：155066·2-27868 SN/T 3965—2014言前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、江西农业大学。本标准主要起草人：冯黎霞、崔汝强、何日荣、武目涛、王卫芳、钟国强。一 SN/T 3965—2014桃色欧文氏菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了进出境植物检疫中桃色欧文氏菌的检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带桃色欧文氏菌的水果、种子以及苗木等繁殖材料的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1809进出境植物种子检疫规程3方法原理桃色欧文氏菌（Erwinia persicina Hao et al.）属肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、欧文氏菌属（Erwinia）。该病菌可以通过种子进行远距离传播。该病菌的生物学、生理生化和分子生物学特性是制定本标准的主要依据（见附录 A）。4仪器设备和用具4.1仪器设备生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、恒温培养箱、PCR仪、电泳设备及其他常规实验室设备。4.22用具剪刀、解剖刀、接种针（环）、镊子、玻棒、培养皿、酒精灯、三角烧瓶、量筒、移液器。53主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。桃色欧文氏菌所用的培养基配方和试剂详见附录B和附录C。6检疫鉴定方法6.1田间调查和植株检验田间调查时采集具可疑症状的植株或果实带回实验室，用清水清洗干净，切取病健交界部位的组织，用灭菌水冲洗1次，75%乙醇消毒60S，无菌水冲洗3次，然后将其移至灭菌培养Ⅲ中，加少量无菌1 SN/T 3965—-2014水，用无菌玻棒挤压或用无菌剪刀将其剪碎，用接菌环蘸取菌液划线接种于NA培养基平板上，28℃培养48h。挑取优势单菌落进行纯化。6.2种子处理对来自桃色欧文氏菌发生国家和疫区（见附录 A)的种子，按照SN/T 1809的规定进行检疫抽样。随机选取种子15g～100g浸泡在无菌水中（按1：5质量体积比），4℃过夜，并用无菌水清洗种子2次,将浸泡液和洗液一并回收至离心管中,然后在 4℃下 6 000g 离心10 min,去上清液,沉淀悬浮于2 mL灭菌水中,分别稀释 101、10²、103倍后在 1/5 NA培养基上涂平板。28℃ 培养 24 h～72 h,每天观察菌落生长状况，纯化单菌落。或者取每份种子·1000粒用无菌水保湿培养种植于温室或光照培养箱中,生长温度为 25℃～28℃,相对湿度大于或等于 70%,种子出苗后一周观察植株感病情况。病变组织处理和病原菌分离培养参照6.1。6.3病原菌的分离培养根据附录 A桃色欧文氏菌在 NA培养基上的菌落特征,挑取可疑的单菌落,在KB培养基或 NA培养基上划线纯化，28℃培养24h～48h，对可疑分离物的菌落特征进行观察和描述记载，并按照6.4、6.5、6.6 步骤操作。6.4致病性测定分离纯化的菌株在NA平板上28℃培养48h后，用无菌水配成10°CFU/mL～10°CFU/mL的新鲜菌悬液，通过针刺或注射等方法接种健康寄主，用无菌水接种健康植株叶片做阴性对照。置于光照培养箱内，26℃，相对湿度80%，光照12h，每天观察发病情况。6.5生理生化测定将可疑分离物菌株进行生理生化试验，具体生理生化指标见附录A。6.6PCR 检测对可疑菌株进行PCR检测，以桃色欧文氏菌标准菌株作阳性对照，以双蒸水作空白对照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。若可疑菌株与阳性对照扩增有253bp条带，空白对照无条带，回收特异性片段进行测序,并利用Blast 进行序列比对分析。7 结果判