SN 1556-2005鸡传染性鼻炎琼脂免疫扩散试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1556—2005鸡传染性鼻炎琼脂免疫扩散试验操作规程Protocol of agar gel immunodiffusion test for avian infectious coryza2005-02-17 发布2005-07-01实施中华人民共和国玫码防行发布国家质量督检验检疫总局 SN/T 1556-—2005前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标主要起草人：文耀南、杨建中、丁有胜。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I SN/T 1556—2005鸡传染性鼻炎琼脂免疫扩散试验操作规程1范围本标准规定了鸡传染性鼻炎琼脂免疫扩散试验的方法。本标准适用于鸡传染性鼻炎抗体的检测。2规范性应用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法（eqvISO3696：1987)3缩略语下列缩略语适用于本标准。AIC avian infectious coryza 鸡传染性鼻炎4器材与试剂4.1器材天平(0.1mg）、吸管、平皿(90.0mm×15.0mm）、外径为5.0mm七孔梅花金属打孔器、微量加样器和微量吸头等。4.2试剂所需试剂如下：一琼脂糖，氯化钠，叠氮钠，盐酸，均为分析纯；-AIC琼脂扩散试验抗原、标准阳性血清；-pH7.2,0.15mol/L磷酸缓冲溶液(PB):见附录A,实验用水要求见GB/T 6682。5操作步骤5.1采样无菌采集被检鸡血液，分离血清，血清应新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一20℃～一30℃冰箱保存或冷藏条件下立即送检。实验前被检血清须统一编号。5.21%琼脂板的制备5.2. 11%琼脂胶的制备取0.15mol/L磷酸缓冲溶液100mL加人琼脂糖1.0g，加热充分溶解后加人氯化纳8.0g，充分溶解。5.2.2制板待琼脂溶液自然冷却至约56℃时，加0.01%叠氮钠，将直径为90mm洁净灭菌的平皿置于水平面平台上，每个平加琼脂溶液约18 ml，使凝胶厚度约3.0mm。加盖待自然冷却凝固，把平血倒置湿盆1 SN/T 1556--2005中，4℃冰箱密封备用。5.3 打孔反应孔现用现打。从冰箱中取出琼脂板，立即按7孔一组（见图1)的梅花圆形打孔（中间1孔，周围6孔）,孔径4.0mm,孔距3.0mm。将孔中的琼脂轻轻挑出或吸出，勿伤边缘及使琼脂层脱离玻璃，以免渗漏，将打孔后琼脂板底部经酒精灯火焰上方快速来回5次～？次加热封底。制好孔型的平血写上日期及编号。图 15.4加样使用时，用微量加样器吸取抗原悬液滴人“Ag”孔，“+”孔加标准阳性血清，其他标有1、2、3数字的分别加人被检血清，每孔加 35 μL～50 μL，每孔均以加满不溢出为度，每加一个被检血清应换一个吸头。5.5 反应加样完毕后，室温静置10min，将平皿放人湿盒于37℃孵育.24h、48h、72h观察结果并记录。6结果判定6.1 判定前提抗原孔与标准阳性血清孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则对照成立，可进行结果判断。6.2 判定标准若抗原孔与被检血清孔间出现清晰致密沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端平滑相连接，位置微向内侧弯曲时,则被检血清判为阳性(见图2)。若抗原孔与被检血清孔间虽不出现沉淀线，但抗原与标准阳性血清孔间的沉淀线在被检血清孔位置微向内侧弯曲者,则被检血清判为可疑反应。对该份血清应复检，仍为可疑则判为阳性反应（见图 3所示第孔）。若抗原孔与被检血清孔之间不出现任何沉淀线，且抗原孔与标准阳性血清孔间沉淀线直向被检血清孔或向其外侧偏弯者，则被检血清判为阴性（见图 4)。若抗原孔、被检血清孔之间的沉淀线与抗原孔、标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉，则判为非特异性反应,应重做。若仍出现非特异性反应则判为阴性(见图 5所示第3孔)。图图 图2图32 SN/T 1556--2005附 录 A(规范性附录)pH 7.2,0.15 mol/L磷酸缓冲溶液(PB)的配制53.7g加无离子水至1000 mL甲液:磷酸氢二钠(Na2HPO·12H²O)23.4g加无离子水至1000mL乙液:磷酸二氢钠(NaH2PO·2H²O)甲、乙液充分溶解后分别保存，用时取甲液720mL，乙液280mL混合即成。 5000--99S1 L/NS中华人民共和国出人境检验检疫行业标准鸡传染性鼻炎琼脂免疫扩散试验操作规程SN/T 1556--2005中国