SN_T 2980-2011动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2980—2011动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法Triple fluorescent real-time PCR detection method for bovine,goat and sheep derived materials in animal products2012-04-01实施2011-09-09 发布0中华人民共和国发布X国家质量监督检验检疫总局数码防伪。 SN/T 2980--2011前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：曾少灵、秦智锋、曹琛福、张彩虹、卢体康、孙洁、阮周曦、杨俊兴、陶虹、陈兵+林庆燕、陈书琨、宗卉、花群义、刘建利、廖立珊。I SN/T 2980--2011动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了采用实时荧光PCR检测方法同时检测动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分。本标准适用于动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分的定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T14699.1饲料采样标准SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3试剂与材料DNA提取用试剂3. 1三氯甲烷。3.1.1Tris 饱和苯酚和三氟甲烷11混合液。.3异戊醇。3.1.4三氯甲烷和异戊醇24：1混合液。3.1.5异丙醇。3.1.63mol/L乙酸钠溶液。3.1.775%乙醇。3.1.8正已烷。1 mol/L、pH8.0 的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸[Tris-H(}溶液 mol/L、pH8.0的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Naz)溶液。3.1.10裂解液I。3.1.11pH8.0 的 Tris-EDTA(TE)缓冲液。3.1.12I3.2荧光 PCR 反应用试剂Tag DNA 聚合酶(5 U/μL)及 10XPCR 反应缓冲液(含 25 mmol/LMg²+）。.2各引物溶液的使用浓度均为10μmol/L：牛源性成分检测用引物(对)序列为：a)5-TGGAGTAATCCTTCTGCTCACAGT-35-TGACTGTTGCTCCTCAGAATGATA-3b）山羊和绵羊源性成分检测通用引物(对)序列为：5′-AGAAACATGAAACATC(T)GGA-3′1 SN/T 2980--20115′-ATATGGAATTGCTGAAAGAA(G)-33.2.3各探针溶液的使用浓度均为10μmol/L：a）牛源性成分检测用探针序列及标记物为：FAM-5-AGCATTTATAGGATACGTCC-3-MGBb）山羊源性成分检测用探针序列及标记物为：ROX-5′-TCCTGCTCGCAACAATGGC-3′-MGBc）绵羊源性成分检测用探针序列及标记物为：HEX-5-TCCTATTTGCGACAATAGC-3-TAMRA3.2.44各10 mmol/L 的四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合溶液。3.3材料实时荧光PCR反应管。4仪器设备4.1实时荧光PCR检测系统。4.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。4.31%电子天平。4.4高速离心机：离心力至少达到12000g。4.5 微量移液器:0. 25 μL～10 μL,10 μL～100 μL,10 μL～200 μL,100 μL～1 000 μl。4.6恒温水浴锅。4.7微量振荡器。4.8掌式离心机。5样品制备5.1饲料样品按照GB/T14699.1进行采样，将试样充分粉碎，混合均匀后待用。5.2其他动物产品样品按照SN/T2123进行采样，将试样充分研磨，混合均匀后待用。5.3固体样品要充分粉碎，保证颗粒大小在100目（即0.125mm）以下。6　DNA提取6.1　样品DNA提取称取适量样品（50mg～100mg）于1.5mlL离心管中，加人600μL～800μL裂解液I（见附录A），65℃水浴30min，每隔10min振荡混匀一次；100℃沸水浴5min；12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加400μL三氯甲烷十异戊醇混合液（见附录A），充分混匀；12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加0.8倍体积的异丙醇，一20℃低温下沉淀DNA30min;12000r/min离心10min,弃去上清液；75%乙醇