SNT 1135.5-2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1135.5—2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法Identification of Ciavibacter michiganensis subsp. sepedonicus2007-12-24发布2008-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1135.5--2007前言SN/T1135共分为五个部分：一马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法；马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；一马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法。本部分是SN/T1135的第5部分。本部分的附录 B、附录 C均为规范性附录,附录 A为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本部分主要起草人：赵文军、陈红运、梁新苗、张乐、朱水芳、魏梅生。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1135.5-2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法1范围SN/T 1135 的本部分规定了马铃薯环腐病菌的检疫鉴定方法。本部分适用于所有进出境马铃薯种薯及商品用薯的检疫和鉴定。2术语和定义下列术语和定义适用于SN/T1135的本部分2. 1..双抗体夹心酶联免疫吸附测定加爽待测样品后，再用酶标记的细菌抗体进行免疫在固相支持物上（酶联板)包被细菌特异性抗识别，最后通过酶促化学反应检测细菌是否存在的种血清学检测方法。2.2PCR以耐热DNA聚合酶和对引物(与待测自标核酸分字序列同源的DNA 片段)通过高温(DNA分子变性)和低温(引物和目标核酸分子复性并被耐热DNA聚合酶延伸）交替循环扩增待测目标核酸分子的方法。3原理）属厚壁菌门（Firmicutes）厚壁细菌纲马铃薯环腐病菌（Claibacsis stdonrrus侬靠病蘑进行远距离传播：寄主及世界分布参见附录A。(Firmibacteria)棒形杆菌属（Claviba4仪器和用具4.1仪器设备PCR仪、超净工作台、灭菌镶、制冰机核酸蛋白分析仪高速冷漆离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、醇标仪。4.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR 缓冲液、氯化镁（MgCl²）、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、TagDNA聚合酶、引物和探针、牛肉汁、酵母膏、磷酸氢二钾（K,HPO4）、磷酸二氢钾（KH,PO4）、硫酸镁（MgSO4）、葡萄糖、琼脂，酶联检测试剂见附录B。5 病菌的鉴定5.1 症状检查取样品量1%～5%(若样品少可适量增大比例)的块茎进行检查。将块茎横切，检查环腐病菌侵染症状,挤压块茎,检查维管组织是否浸解。发病轻者维管束变黄，呈不连续的点状变色；重者整个维管束环变色。病菌也可侵害块茎维管束周围的薄壁组织，呈环状腐烂，严重时可引起皮层与髓部组织分离，轻轻挤压块茎从维管束中涌出奶酪样的柱状物。块茎表面的症状在轻度危害时不明显，随病害发展，皮色变暗或变褐，严重时表皮可出现裂缝。5.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法对样品进行初筛（见附录B)，若检测结果为阳性，需进行病原 SN/T 1135.5--2007菌的分离培养及5.4方法测定。5.3病原菌的分离培养5.3.1培养基的制备营养肉汤酵母膏培养基(NBY)：牛肉汁8.0g，酵母膏2.0g,磷酸氢二钾（K,HPO4)2.0g,磷酸二氢钾(KH²PO)0.5g,葡萄糖2.5g,琼脂15.0 g,水 iL,灭菌后加1mL过滤灭菌的1mol/L硫酸镁（MgSO4)溶液。5.3.2块茎中病原菌的分离培养马铃薯块茎洗净后用75%乙醇表面消毒5min，从带病薯块的维管束挑取少量菌脓在NBY培养基上划线或从带病块茎的维管束圈切取少量病组织，在灭菌水中捣碎制成悬浮液，用接菌环蘸菌悬液划线，经两次纯化培养后转人培养基斜面。5.4PCR 凝胶电泳检测见附录 C。6结果判定若酶联免疫检测结果为阳性，可初步判定为检出马铃薯环腐病菌，需利用5.4方法进一步检测。在5.4检测中,若PCR凝胶电泳检测结果为阳性，而且扩增片段大小与描述相符可判定为马铃薯环腐病菌。7样品保存与复核7.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出马铃薯环腐病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。7.2菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为马铃薯环腐病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于 NBY培养基斜面上，28℃培养48h，然后4℃冰箱保存，或液体培养至对数生长期，加人20%灭菌甘油并混匀，一80℃长期保存或用安管冷冻干燥长期保存。对不需要长期保存的菌株应及