NYT 1740-2009大豆中异黄酮含量的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 67.060B 23NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1740--2009大豆中异黄酮含量的测定高效液相色谱法Determination of isoflavones in soybean by HPLC2009-04-23发布2009-05-20实施中华人民共和国农业部5发布 NY / T 1740--2009前言本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：农业部作物品种资源监督检验测试中心、中国农业科学院作物科学研究所。本标准主要起草人：李为喜、刘方、王述民、朱志华、刘三才。I NY/T 1740-2009大豆中异黄酮含量的测定高效液相色谱法1 范围本标准规定了利用高效液相色谱法对大豆中异黄酮化合物分离、检测的方法。本标准适用于大豆籽粒中异黄酮(黄豆苷、黄豆黄素苷和染料木苷)含量的测定。单个异黄酮化合物的最低检出限为 20 mg/kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括堪误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T 601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T 5497粮食、油料检验水分测定法GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3.原理试样中的异黄酮化合物经有机溶剂提取后，直接注入反相色谱柱，不同的异黄酮化合物在色谱柱上先后流出，经紫外光谱检测后与标准样品对比,进行定性定量分析。4试剂和溶液本标准所用试剂在未注明其他要求时，均指符合相应国家标准的分析纯试剂。除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水,符合 GB/T 6682规定的一级水。本标准所述溶液如未指明溶剂,均为水溶液。4.1 甲醇:色谱纯。4.2冰乙酸：色谱纯。4.3甲醇溶液：80%(80十20)，用甲醇(色谱纯)加水配制。4.4甲醇溶液：50%（50+50），用甲醇（色谱纯)加水配制，过0.45um微孔滤膜。4.5氢氧化钠溶液:c(NaOH)=2 mol/L,按 GB/T 601 配制。4.6标准品：黄豆苷(daidzin）、染料木苷（genistin)和黄豆黄素苷（glycitin），含量均大于95%。4.7标准贮备液的配制：称取5mg黄豆苷、5mg染料木苷、5mg黄豆黄素苷,精确至 0.01 mg,分别置于50mL容量瓶中,用甲醇溶解,稀释至刻度。单个贮备标准溶液的浓度分别为：黄豆苷 100μg/mL,染料木苷 100 μg/mL，黄豆黄素苷 100 μg/mL。4.8混合标准液配制：分别吸取单个贮备标准溶液1mL置于同一个100mL容量瓶中，加人50%的甲醇溶液稀释至刻度。4.9标准工作液配制：使用前，将混合标准溶液用50%甲醇溶液（4.4)稀释成所需浓度的标准工作液，绘制标准曲线。5仪器和设备5.1分析实验室常用仪器设备。5.2高效液相色谱仪，附带紫外或二极管阵列检测器。 NY/T 1740—20095.3 色谱柱:C18反相柱。5.4分析天平：最小分度值为0.00001g。5.5恒温水浴振荡器。6 分析步骤6.1试样的制备去除大豆籽粒样品中杂质，取50g样品置于样品磨中粉碎，至全部通过0.5mm孔径样品筛。6.2试液的制备称取试样2.0g～2.5g(精确至0.0001g），置于250mL具塞三角瓶中，加人80%甲醇溶液（4.3)40mL，盖紧瓶塞，用铝箔将瓶口封上，将三角瓶置于（65士2)℃的恒温水浴振荡器中，在（180士10)r/min的振荡频率下振摇2 h。取出三角瓶放置至室温,加入2mol/L氢氧化钠溶液（4.5)3mL，盖紧瓶塞，用铝箔将瓶口封上，置于康氏振荡器上，室温下振摇10min后，取下三角瓶，加入1mL冰乙酸(4.2)并在涡旋混合器上混匀，将全部试液转人50mL容量瓶中，用80%甲醇溶液(4.3)稀释至刻度。使用定量滤纸过滤。量取2.5mL滤液置于10mL容量瓶中,加入4mL水，用甲醇(4.1)稀释至刻度,摇匀，于3000 r/min下离心5min,取上清液置于样品瓶中，待测定。6.3测定6.3.1 色谱柱Symmetry C18反相柱,5 μm,3.9mmX150 mm,或相当类型的色谱柱。6.3.2流动相流动相A:甲醇+冰乙酸(98十2)；流动相B：水+甲醇+冰乙酸（88+10十2）。6.3.3色谱分析流速：0.8mL/min;柱温：室温；检测器：紫外检测器；检测波长：260 nm;进样量：20uL。梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序流动相 B(%)流动相 A(%)流速(mL)时间(min)阶段95. 05. 00. 80. 0195.05. 00.813. 0260. 040. 00.817.0360