SNT 1693-2006牛流行性热微量血清中和试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1693—2006牛流行性热微量血清中和试验操作规程Protocol of micro-serum neutralization test for bovine ephemeral fever2006-01-26 发布2006-08-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局我条腔 8185615号 高数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准牛流行性热微量血清中和试验操作规程SN/T 1693-2006中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. bzcbs. com电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 880×12301/16印张0.5字数8千字2006年4月第一版　2006年4月第次印刷印数 1--2 000 SN/T 1693—2006言前本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：蓬俊、贾建军、杨建明、赵玉书、赵颜润、蒋泽华。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1693—2006牛流行性热微量血清中和试验操作规程1 范围本标准规定了牛流行性热微量血清中和试验操作规程：本标推适用于牛流行性热病的检验检疫。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款欠。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本标准，3. 1BEF ° bovine epheral fever牛流行热。3.2TCIDso 50% tissue culture infectious dose组织培养半数感染量。3.3CPE cytopathic effect细胞病变。4设备、材料和试剂4.1设备4.1.1超净工作台。4.1.2振荡器。4.1.3倒置显微镜。4.1.4二氧化碳培养箱4. 1.5可调单头或多头微量移液器(50uL～200μl,50μLT 000 μL)4. 1.6 移液吸管(1 mL、2 ml、5 mL.10 mL、20 mL)。4.1.7微量离心机。4.2材料4.2.196孔细胞培养板。4.2.2微量离心管。4.2.3细胞培养瓶。4.3试剂4.3.1标准种毒、标准阳性血清和阴性血清。4.3.2BHK-21 或 Vero 细胞。 SN/T 1693-20064.3.3199或MEM培养基，4.3.4胰蛋白酶。4.3.5犊牛血清：不含细菌、支原体及无牛流行热抗体，56℃灭能30min。4.3.6青霉素、链素。5操作步骤5.1 病毒繁殖将培养24 h～48h已长成单层、形态良好的BHK-21细胞，弃去培养液，用维持液将细胞洗涤2次～3次，按细胞培养液培养量的10%加人10-²稀释的牛流行热病毒，37℃吸附1h(其间轻轻振荡数次）。吸去病毒余液，用维持液洗涤一次，加人细胞维持液，放37℃培养箱内培养，逐日观察，当细胞CPE达75%以上时,将培养物放一70℃冻结保存。5.2病毒毒价测定将收获的细胞病液冻融三次，以2000r/min离心10min，吸取上清液作10蓓倍比稀释，在微量板上用BHK-21细胞作50 μL病毒量的毒价测定，每孔的体积为200 μl。按改良的 Reed-Muench或Karber方法计算TCIDso，本试验要求毒价达10*以上。经测定毒价符合要求的病毒抗原分装小瓶置一70℃或液氮中保存备用。超过3个月保存期的病毒用前需重新测定价。5.3被检样品的采集和处理用无萄注射器或专用采血管无菌自牛静脉或尾中动脉采血，无菌分离血清编号备用。试验时，被检血清、阳性血清、阴性血清分别经 56℃温育 30 min 灭能。5.4中和试验5.4.1被检血清稀释用移液器吸取已被灭能的每份被检牛血清70μL，滴加在微量板上，每孔一份血清直至加完被检血清为止，然后用单头或8头移液器吸取稀释液210μL加人被检血清孔内，并充分混合（此时血清被稀释成4倍），被稀释血清总量为280μL。5.4.2病毒稀释试验时，按需要量将被测得毒价的病毒作每50μL中100 TCIDs稀释。例如病毒毒价测定时每50 μL含有 10°个 TCIDso，使用时将病毒作1 000 倍稀释,即取病毒 1mL加维持液 999 mL。5. 4.3细胞对照设4孔细胞对照（每孔加维持液100μI)。5.4.4 病毒对照将病毒稀释成每 50 μL中 100 TCIDs。、10 TCIDso、