SN_T 1164.2-2003牛传染性鼻气管炎微量血清中和试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1164.2-—2003牛传染性鼻气管炎微量血清中和试验操作规程Protocol of micro-serum neutralization test forinfectious bovine rhinotracheitis2003-03-17发布2003-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1164. 2--2003前言本标准的试验方法是参考国际兽疫局(OIE)《诊断试验和疫苗标准手册》介绍的方法，并经过长期实践、改进，使之进一步具体化，而形成现行的标准。本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：苏卫、张晓丁、王涛、李凌枫。本标推系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1164.2--2003牛传染性鼻气管炎微量血清中和试验操作规程1 范围本标准规定了牛传染性鼻气管炎微量血清中和试验方法本标推适用于牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标推的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标推，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T 6682—1992分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本标。3. 1CPE致细胞病变作用。3.2TCID50半数组织培养感染量。3.3IBR牛传染性鼻气管炎。4原理动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，从而阻止病毒对敏感细胞的吸附,或抑制其侵人，使病毒失去感染力。微量血清中和试验是在微量细胞培养板上，用已知标准病毒株测定未知血清抗体。当相应的抗原抗体发生中和反应后，阻止了已知病毒对敏感细胞的侵袭，从而细胞不出现病变。5试剂和材料5.1 本标所用水应符合 GB/T 6682一1992 中级水的规定。5.2本标准所用溶液配制见附录 A。5.3IBR 标准毒株(Baitha-Nu/67 冻干或其他标准毒株)和标准阳性、阴性血清(由指定单位提供)。5. 4 细胞:使用 MDBK 细胞或三代以内体外培养的未感染 IBR 病毒的胎牛肾细胞(BK)、睾丸细胞(BT),细胞浓度约为3×10° /mL。BK 或 BT细胞的制备：无菌采取初生牛肾或睾丸，磨碎或剪碎,再1 SN/T 1164.2--2003用胰蛋白酶消化制备细胞，置37℃二氧化碳培养箱，长成良好单层备用。5.5被检血清：用无菌注射器或采血专用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清编号后备用。本方法使用的阳性血清、阴性血清和被检血清须经56℃30 min 处理。6器械和设备6.1倒置光学显微镜。6.2二氧化碳培养箱。6.3冰箱（一20℃保存血清，一70℃保存种毒）。6.4无菌96孔细胞培养板，50μL、100μuL微量可调移液器，无菌塑料滴头，无菌塑料离心管（1.5mL）或 5 mL～10 mL 无菌玻璃试管。7种毒繁殖将冻干IBR标准毒用不含血清的维持液（配制见附录A)作10倍稀释，取长成良好单层的细胞，用Farle液（配制见附录A)洗一次后，按原培养液十分之一的量接毒，置37℃温箱吸附0.5h～1h，然后加人维持液(配制见附录A)至原培养液量，置37℃二氧化碳培养箱培养，逐日观察，待80%～~90%细胞出现病变时收获病毒悬液冻融或超声波处理后，3000r/min离心10min，取上清液，测定病毒毒力滴度（TCIDs。)并分装小瓶，置-70℃贮存备用。8 病毒毒力测定制备的病毒抗原或购进的标准病毒抗原，用维持液将其作10倍递增稀释至10-8，每一个滴度病毒稀释液接种细胞培养板八孔，每孔50uI。随后每孔加人细胞悬液（3×105/mL）100双L和细胞培养液50μL。同时每板设八孔细胞对照。置37℃二氧化碳培养箱培养，逐日观察至6d并记录细胞病变，按Reed-Muench方法计算培养细胞半数感染量（TCIDso/50μL）。9试验程序9.1阴性血清对照：设二孔，每孔加阴性血清50μL、100TCIDsc/50μL的病毒悬液50μL，置37℃温箱中和1h。9.2阳性血清对照：先将阳性血清作1：2、1：4稀释至2-？，每一稀释度二孔，每孔加阳性血清50 μL，100TCIDso/50μL的病毒悬液50μL,置 37℃温箱中和1h。9.3细胞对照：设四孔细胞对照（每孔加维持液100μL）。9.4病毒回归对照:将 IBR病毒稀释成100、10、1、0.1TCID5o/50 μL，每一稀释度孔，每孔加病毒悬液50 μL、维持液 50 L9.5被检血清：