NYT 1468-2007丝状支原体山羊亚种检测方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1468—2007丝状支原体山羊亚种检测方法Methods for Detecting Mycoplasma mycoides subsp. capri2008-03-01实施2007-12-18 发布中华人民共和国农业部发布 NY/ T 1468—2007前言世界动物卫生组织 [World Organization for Animal Health （英)， Office Intentional des Epizoo-tic（法），OIE」编写的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（第五版，2004）中，山羊接触传染性胸膜肺炎的病原为山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.caripneumoniae，Mccp）。在本标准中，山羊接触传染性胸膜肺炎的病原是丝状支原体山羊亚种（PG:）。虽然病原不同，但其诊断技术标准同步。本标准附录 A、附录 B、附录 D 和附录 I 均为资料性附录；附录 C、附录 E、附录 F、附录 G 和附录 H 均为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：逮忠新、储岳峰、赵萍、高鹏程。I NY/T 1468—2007丝状支原体山羊亚种检测方法1 范围本标准规定了丝状支原体山羊亚种病原学和血清学诊断方法要求。本标准适用于由丝状支原体山羊亚种引起的山羊接触传染性胸膜肺炎的诊断。2病原学检查2.1材料准备2. 1.1 培养基20%马血清马丁肉汤；20%马血清马丁琼脂；葡萄糖酵解培养基；精氨酸水解培养基；磷酸酶培养基（BPh)；凝固血清消化培养基（Sd)；菌膜、菌斑形成试验培养基。制备方法均参见附录 A(A. 1~A. 7)。2. 1. 2 试剂NET缓冲液（参见附录 B.1)、TAE电泳缓冲液（参见附录 B.2)；十二烷基硫酸钠（SDS)、RNase A、蛋白酶 K、酚一氯仿一异戊醇（25：24：1）、无水乙醇、Taq DNA 聚合酶、10X PCRbuffer（含 Mg²+）、脱氧三磷酸核苷酸混合液（dNTPs）、OX174-HaeⅢdigest DNA分子质量标准、琼脂糖、溴化乙锭、灭菌双蒸水。2. 1.3 引物Pc1 5- TAT ATGGAG TAA AAAGAC-3Pc2 5-AATGCA TCA TAA ATA ATTG-3Pc3 5- TTA ATA AGTGTG TAT ATG AAT-3Pc4 5- ACT GAG CAA TTC CTC TT - 3引物在使用时用灭菌双蒸水稀释为25 umol/L～50 μmol/L。2.1.4其他材料兔抗支原体血清（ra-m)、健康兔血清（NRS)，制备方法见附录C。抗兔免疫球蛋白荧光抗体（a-r Ig-FITC)。灭菌器械（剪刀、镊子、吸管、青霉素瓶等）。2.2病料采集2.2.1活体病料采集：将棉拭子伸人待检山羊鼻腔内采集分泌物，放人无菌试管中立即送往实验室供分离。2.2.2剖检病料采集：采集肺病变部、特别是硬变部位和非硬变部位的交界处的样品以及胸水和纵隔淋巴结。2.2.3样品运送：采集的样品，应在4℃条件下24h内送到实验室。如果不能立即进行微生物学检查，可将样品或整个肺置一20℃冷冻保存1个～2个月。2.3 病原分离样品拭子悬浮于2mL～3mL20%马血清马丁肉汤中。组织样品用剪刀剪碎，每1g加20%马血清马丁肉汤9mL，强烈震荡；或在培养基内捣碎。胸水、组织悬液或拭子均需用20%马血清马丁肉汤做3个10倍系列稀释，稀释到10-4。将样品的各稀释液分别接种于20%马血清马丁肉汤和琼脂培养基，培养血用胶布封口，置 37℃培养5d～7d，每天观察一次。如未见生长，可按上述方法连传3y NY/T 1468-2007代。2.4病原鉴定2.4.1培养特征培养性状和菌落形态阳性样品在20%马血清马丁肉汤中培养4d～5d后，呈轻度混浊带乳光样纤细菌丝生长，无菌膜，无沉淀，无颗粒悬浮。在马丁琼脂斜面或平板上生长迟缓，生长的菌落与微小的水滴相似（露滴状透明菌落），用放大镜仔细观察，可见大小悬殊且不很圆整的圆形或椭圆形菌落，中央乳头状突起明显（煎蛋状）。菌落直径0.3mm～0.5mm。染色镜检以细菌培养物抹片，用姬姆萨氏染色法（参见附录D）染色、镜检。呈淡紫色细小的球状、双球状、弧状等多形态。直径 125 nm～250 nm。2.4.2生化特性糖酵解试验：从琼脂斜面上挑取少量待检菌培养物，接种于糖发酵管（参见附录 A.3）培养液内，置 37℃温箱内培养5d～7d。水解葡萄糖产酸时，颜色变黄。精氨酸水解试验：将待检菌培养物接种于精氨酸水解培养基（参见附录 A