SN_T 1135.11-2013马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1135.11—2013马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Polyscytalum pustulans (M.N.Owen et Wakef.)M.B.Ellis2014-06-01实施2013-11-06发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局商涂屋查式份 中华人民共和国出入境检验检疫行业标示准马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法SN/T 1135.11--2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100015）总编室：(010址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.75字数16千字2014年4月第一版2014年4月第一次印刷印数1-1600*书号：155066·2-26930 SN/T 1135.11—2013前言本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。本部分起草人：吴品珊、杜洪忠、严进、张秋娥1 SN/T 1135.11—2013马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法1范围SN/T1135的本部分规定了马铃薯皮斑病菌的检疫鉴定方法。本部分适用于马铃薯块茎上马铃薯皮斑病菌的检疫和鉴定。2病菌的基本信息中文名：马铃薯皮斑病菌英文名：Skin spotof potato学名: Pol yscytalum pustulans (M.N.Owen et Wakef.)M.B.Ellis异名:Oospora pustulans M.N.Owen Wakef.分类地位：真菌界（Fungi），有丝分裂孢子真菌（Mitosporicfungi)，蛇孢霉属（Polyscytalum）。传播途径：病菌的初侵染源是块茎，病菌孢子可以通过雨水、灌溉近距离传播，远距离通过种薯或带病土壤进行传播。马铃薯皮斑病菌的其他信息参见附录A3方法原理以马铃薯皮斑病菌形态学特征和分子生物学特征为鉴定依据。4仪器和用具4.1仪器生物显微镜（具测量功能），体视显微镜，超净工作台，生物培养箱，天平，高压灭菌锅，台式高速离心机，pH计，水浴箱，实时荧光PCR扩增仪。4.2用具烧杯，三角瓶，量筒，试管，培养皿，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，接种针，载玻片，盖玻片，塑料研杆，移液器，移液器吸头，离心管，液氮罐。5试剂和培养基5.1试剂葡萄糖，琼脂粉，液氮，Tris-HCl,MgCI²，HCl,EDTA，NaOH，NaOAC,KCI,Tris,CTAB,TAE，无水乙醇（Ethanol)，SYBRGreen I核酸染料，氯仿（Chloroform），异丙醇（Isopropanol），异戊醇（Isoamylalcohol)，蛋白酶K，TaqDNA聚合酶，dNTP，通用引物ITS5和ITS4，实时荧光PCR特异性引物PpustF1、PpustR2及探针PpustPrl。1 SN/T 1135.11—20135.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。具体配方参见附录A。6实验室检疫6.1症状检查观察马铃薯块茎上是否具有浅棕色的病斑以及紫黑色且略微凸起的病斑。挑选具类似病斑的马铃薯块茎进行分离及保湿培养。病害症状图参见附录A。6.2分离培养取疑似症状病斑的病健交界处组织，用70%乙醇表面消毒1min，灭菌水冲洗3次，置于PDA培养基平Ⅲ中，20℃培养，培养3d～5d后开始观察。若发现白色或灰白色菌落，转接到新的PDA培养基平皿上，培养5d后开始观察病菌的菌落培养性状，同时在显微镜下观察记录分生孢子、产孢细胞的形状、大小等。6.3保湿培养将疑似症状的马铃薯块茎，置密闭塑料盒中15℃～20℃高湿度下培养5d，若病斑处长出病菌的子实体或菌丝体，用接种针挑子实体或菌丝体直接制片，置显微镜下观察，记录分生孢子、产孢细胞的形状、大小等。6.4分子生物学检测6.4.1DNA提取按CTAB方法提取DNA参见附录B。6.4.2实时荧光PCR检测实时荧光PCR引物序列为PpustF1：5-AGCGCCCCACAGAAGCC-3，PpustR2：5-GACCGAACTTCTCCGAGAGGT-3，TaqMan 探针PpustPrl：5-FAM-CGGCTCTAAACCCTACCGAAGTAGGGTAGC-BHQ-3。探针5端标记的荧光报告基团为FAM，3端标记的荧光猝灭基团为BHQ-1.25μL反应体系中含：样品DNA1μl，10×PCRbuffer2.5μl，25mMMgCl.2μl,2.5mMdNTps2μL,10μMPrimers个1μL,10μM探针PpustPrl1.5μL,5U/μLTaqDNApol