SN_T 3306.1-2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第1部分：鼠疫杆菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3306.1—2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第1部分：鼠疫杆菌Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 1:Yersinia pestis2012-12-12发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局O冷质动 SN/T 3306.1-2012前#創言SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》共分为4部分：第1部分：鼠疫杆菌；-一第2部分：产毒素霍乱弧菌；一第3部分：志贺氏菌；第4部分：嗜肺军团菌。本部分为SN/T3306的第1部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：田桢于、李国鹏、李强、方筠、陈磊、左锋、陆晔、章琪、李晓虹、何宇平、李平、卢钟山、王婷、曹以诚、杜正平、陈洵。I SN/T3306.1—2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第1部分：鼠疫杆菌1范围SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测疑似鼠疫样本、不明物质等样品中鼠疫杆菌的环介导恒温扩增（LAMP)法。本部分适用于国境口岸鼠疫杆菌的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件。其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用WS279—2008鼠疫诊断标准3缩略语下列缩略语适用于本文件。Betaine：甜菜碱Bst酶[BstDNApolymerase（largefragment)]：BstDNA聚合酶（大片段）DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷三磷酸EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid)：乙二胺四乙酸LAMP（loop-mediatedisothermalamplification）：环介导恒温扩增TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测鼠疫杆菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。5防污染措施防止污染措施应符合WS/T230的规定。- SN/T3306.1—20126技术概要根据鼠疫杆菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，特异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合：产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，可观察判断结果；另加人核酸显色液，可观察颜色变化判定结果。7试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1引物：根据鼠疫杆菌特异性PLA基因序列，分析设计出，能专二性鉴别鼠疫杆菌的特异性引物组，该引物组由如下四条引物组成：外引物1(F35-3):CGGCTCACGPTATTATGG外引物2(B3,5-3)TTTATTGGAAATACCGGCAG内引物1(FIP,5-3）：ACTGTATGTA AATTCCGCAA AGACTTTTIA CCGTAATTAA CGCTGGAT内引物2(BIP,5-3):ATGATGAGGGCAAAGGAGGTTTTTCTCCGC CAATAGAGACAG7.2DNA提取液：含20 mmol/LlFris-HCl-(pH8-02-mmol/L-EDTA和1. 2%Triton X-100。7.3dNTPs:每种核苷酸浓度10mmol/L7.4 Bst酶:8U/μuL。7.510×ThermoPol缓冲液：含/205mmol/L/Tris-HCl（pH8.8）)100mmol/LKCl、100mmol/1(NH)2$O.20 mmol/L MgSO./1%Triton X/100。7.6MgSO4:150mmol/L7.7甜菜碱：5mol/L。7.8显色液：浓度为1000XSYBRG