SN_T 3577-2013转基因成分检测 棉花PCR-DHPLC检测.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3577-2013转基因成分检测棉花PCR-DHPLC检测方法Detection of genetically modified components-Method for cotton using PCR-DHPLC2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局O刮涂层查真伪 SN/T 3577—2013言前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院、深圳博睿祥晖生物技术有限公司、国家纳米科学中心。本标准主要起草人：章桂明、朱水芳、向才玉、程颖慧、凌杏园、汪朝晖、朱劲松、黄新、欧阳辉、王颖、仲建忠。 SN/T 3577—2013转基因成分检测棉花 PCR-DHPLC检测方法1范围本标准规定了进出境棉花中转基因成分和品系的PCR-DHPIL.C检测方法。本标准中检测方法适用于转基因棉花品系MON531、MON1445、MON1698、MON15985中的转基因成分和品系的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求3原理变性高效液相色谱技术（denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，在50℃条件下分析样品，碱基对的数量决定样品峰的洗脱顺序，当过柱的乙浓度提高，核酸片段会根据相对分子质量从小到大的顺序被洗脱出来。本标准采用多重PCR方法针对转基因棉花含有的转基因成分同时进行扩增，扩增产物用DHPLC进行分析。通过DHPIC得到的洗脱峰与marker比较确定相对分子质量大小，判定是否带有外源基因成分及确定转基因棉花品系。4设备、用具及试剂4.1设备及用具组织粉碎机、PCR仪、DHPIL.C仪、水浴锅、电子天平（精度：1/1000以上）、普通离心机、低温冷冻高速离心机、冰箱、低温冰箱、制冰机、恒温干燥箱、pH计、移液器（0.1 μI,0.5 μL，2μL，10 μI,20 μL，100 μL,200 μL，1000 μL）、紫外可见分光光度计、纯水机、高压消毒锅、PCR管(0.2 mL）、离心管（1.5mI，2. 0 mL)、Tip 头(0.1 μL~10 μL,5 μL200 μL,100 μL~500 μL)。4.2试剂CTAB提取液、Tris 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、70%乙醇、RNA酶（10 mg/mL）、多重 PCR反应液缓冲液(Multiplex PCR Mix)、Taq DNA聚合酶,DHPLC缓冲液 A:TEAA(0.1mol/I,pH7.0)、乙腈(0.025%）,DHPLC缓冲液 B:TEAA(0.1 mol/L,pH7.0)、乙腈（25%),DHPLC缓冲液 D:乙腈(75%，pH7.0)、分子量标记(marker)。1 SN/T 3577--20135抽样与制样按照GB/T19495.7进行。6DNA 提取及浓度测定6.1　DNA提取6.1.1CTAB方法CTAB方法步骤如下:a）称取300mg磨碎的样品（包括植株、种子和叶片等），迅速转人2mL离心管中，加65℃预热的CTAB提取液700μL混，放入65℃水浴锅中水浴30nin;b）加 5 μL RNase(10 mg/ml),37 ℃水浴30min;加人等体积Tris饱和酚，充分混匀，12000r/min离心15min;c）d）取上清液，加人等体积的三氯甲烧/异戊醇（24-1)混匀，12000r/min离心10min，重复该步骤1次；e）加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，望于一20℃冰箱静置30min，12000r/min离心15 min;f)弃上清液，加人70%乙醇500uL，12000r/min离心3min，去上清液，重复该步骤2次得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加人50.L～100μLTE或无菌去离子水，充分溶解g）后，测量DNA的纯度和浓度后置于20℃你箱中保存。6.1.2试剂盒法不同基因组DNA提取试剂鑫：使用H按操作说明书操作6.2DNA 浓度测定样品DNA用紫外分光光度f测定260nm和280jnm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：DNA纯度=OD260 /@D28DNA浓度=50×OD260mg/