SN 1559.1-2005非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1559.1—2005非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程Protocol of direct immunofluorescent assay for African swine fever2005-02-17 发布2005-07-01实施中华人民共和国发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1559.1—2005前言本标准参照了国际动物卫生组织（OIE)公布的《诊断试验和疫苗标准手册》（2004年版）关于非洲猪瘟诊断中的免疫荧光抗体试验方法。本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘中勇、许如苏、游洪、周军。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1 SN/T 1559.1—2005非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程1范围本标推规定了直接免疫荧光试验检测非洲猪瘟病毒的方法。本标准适用于非洲猪瘟病毒的检测。2仪器设备2.1冷冻切片机。2.2恒温培养箱。2.3荧光显微镜。2.4 冰箱。2.5 leigton 管(160 mmX16 mm)。3 试验材料3.1 非洲猪瘟标准毒株。3.2非洲猪瘟荧光抗体:使用前用稀释液稀释至工作浓度。3.3蒸馏水（pH7.4），配制方法参见附录A。3.40.01 mol/LpH 7.4 PBS(磷酸盐缓冲液),配制方法参见附录 A。3.5缓冲甘油：使用中性无自发荧光的甘油(分析纯)配制，配制方法参见附录A。3.6丙酮:使用前置冰箱预冷。3.7待检组织：无菌采取可疑病猪的脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结，置于尽可能的低温、但不能冻结的容器内运送、保存。4操作方法4.1待检组织制备4.1.1组织切片、印片或涂片将待检组织制成厚度为 4 μm～7 μm的冰冻切片,也可制成印片或涂片。4.1.2白细胞培养物涂片配制组织悬液用组织研磨器或捣碎器将被检组织磨碎，加人0.01mol/LpH7.4PBS和抗菌素，配制成20%的组织悬液(每毫升组织悬液的抗菌素含量为：青霉素 1000 IU,链霉素1mg，庆大霉素 50 IU,制霉菌素50 IU),备用。制备白细胞采取健康猪血，用玻璃珠脱纤或用肝素抗凝（每毫升猪血含肝素100 IU)，700 g离心30 min，吸出血清或血浆备用。另外吸取白细胞，并用细胞基础培养液洗涤3次，备用。配制细胞培养液用上述血清或血浆加细胞基础培养液配制成细胞培养液,使血清或血浆的终浓度为10%~～30%。1 SN/T 1559.1--20054. 1.2.4培养白细胞将白细胞悬浮于细胞培养液中，使细胞含量为10° /mL。分装于160 mm×16 mm 的leigton 管中，每管1.5mL,将试管与水平面成5°～10°倾斜放置,置于5%二氧化碳环境中,37℃培养2d~～4d。接种每份组织悬液接种 3管白细胞培养物，每管接种0.2mL。置于5%CO，环境中，37℃培养2 d~4 d。取1管白细胞培养物接种非洲猪瘟标推毒株作阳性对照。另取1管白细胞培养物不接种病毒作阴性对照。涂片用已接种待检组织的白细胞培养物涂片，制成待检标本。用阳性对照管的细胞培养物涂片，制成阳性对照标本。用阴性对照管的细胞培养物涂片，制成阴性对照标本。4.2固定分别将上述标本在室温下自然风于，用预冷丙酮固定10 min。4.3漂洗将上述标本分别用 0.01 mol/L pH 7.4 PBS漂洗 3次,每次 5 min,最后用蒸馏水漂洗 3min。4.4加荧光抗体在标本上滴加上作浓度的非洲猪瘟荧光抗体，然后将标本放入湿盒内，置于37℃恒温培养箱内温育1 h。4.5漂洗重复4.3，自然风干。4.6镜检于标本上滴加1滴缓冲甘油，置荧光显微镜下检查。5 结果判定阴性对照的细胞无荧光产生，阳性对照的细胞出现荧光，则对照成立，可进行结果判定。待检标本的细胞出现荧光的,判定阳性。待检标本的细胞无荧光出现的，判定阴性， SN/T 1559.1—2005附录A(资料性附录)试剂配制A.1pH 7.4蒸馏水用盐酸或氢氧化钠调蒸馏水的pH值至7.4。A.20.01 mol/LpH 7.4 PBS(磷酸缓冲盐溶液)磷酸二氢钾（KH,PO）0.26 g2.89 g磷酸氢二钠(NaHPO·12H,O)氯化钠(NaCl)8.50 g加蒸馏水至1 000 mLA.3缓冲甘油甘油9 mL1 mI.0. 01 mol/L pH 7. 4 PBS 100160中华人民共和国出人境检验检疫行业标准非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程SN/T 1559.1—2005*中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*