SN_T 3485-2013牛焦虫病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3485—2013牛焦虫病检疫技术规范Quarantine protocol for bovine babesiosis and theileriosis2013-03-01发布2013-09-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局杏真 SN/T 3485—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准参考了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2010年版）中2.4.2牛巴贝斯虫病的血虫体检查、聚合酶链式反应（PCR）、间接免疫荧光试验与微量补体结合试验，并细化了血虫体检查的结果判定、PCR方法的实验操作与结果判定及补体结合试验的预备试验等内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国宁夏出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准的主要起草人：石建平、孟日增、郝俊虎、宋战昀、孟庆峰、刘阳、鱼海琼、刘金华、王伟利。1 SN/T 3485-—2013牛焦虫病检疫技术规范范围1本标准规定了牛焦虫血虫体检查、聚合酶链式反应(PCR)、间接荧光抗体试验和补体结合试验等实验室检疫技术。本标准适用于进出境牛焦虫病的诊断与检疫2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。瓦是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1678 梨形虫病病原鉴定方法SN/T 2685　泰勒氏焦虫检疫规范3疾病概述焦虫病是由焦虫纲焦虫目的原虽所引起的家畜各种疾病的总称。牛焦虫病主要包括牛巴贝斯虫病和泰勒氏焦虫病，牛巴贝斯虫病参见附录A,泰勒氏焦重病参见附录B。4诊断技术4.1 病原学检查4.1.1血虫体检查样品采集血液样品4. 1. 1. 1. 1无菌采集耳尖或尾尖采血样，也可颈静脉无菌采集用 EDTA(1mg/mL）作抗凝剂的抗凝血，4℃保存。4.1. 1.1.2 组织标本无菌穿刺，采集待检动物肩前淋巴结或腹股沟淋巴结组织、肝脏或脾脏制成组织涂片。.3动物户体死亡动物应在其死亡后24 h内完成采样工作。病死牛样品除做血涂片外，还可采取大脑皮层、肾、肝、肺和骨髓等组织做涂片进行检查。血涂片的制备用洁净的载玻片端边缘蘸一小滴血，再用另一端边缘光滑的载玻片做推片,将推片的一端置于血滴一 SN/T 3485—2013之前，待血液沿推片端缘扩散后，均匀推成薄血膜，也可取小滴血液（约50I)滴在干净的载玻片上。自然风干形成厚血片。组织涂片的制备脏器涂片的制作可用一块洁净的载玻片轻触脏器的新鲜切面或以两块洁净的玻片轻夹一小块组织，沿玻片的纵向推压，使两玻片上都留下一层组织。涂片风干后，无水甲醇固定5min，再用10%姬姆萨（配制参见附录 C的 C.1)染色 20 min～30 min。血涂片或组织涂片的染色涂片待其自然风干后，无水甲醇固定1min,10%姬姆萨染色 20 min～30 min;厚血片与组织涂片风干后，80℃烘箱固定5min，10%姬姆萨染色15min～20 min。病原鉴定按SN/T1678中规定的方法进行实验和结果判定。4.1.2牛巴贝斯焦虫聚合酶链式反应试剂与材料.1牛巴贝斯焦虫参考虫株：由指定单位提供。.2rTaq酶：5U/μL,保存于20℃，避免反复冻融或温度剧烈变化，随用随取。.310 倍 PCR 缓冲液:含 50 mmol/L KCI,10 mmol/I Tris-HCl(pH 8.5),2.5 mmol/LMgCl2,0.001%明胶。.410 mmol/LdNTP混合液:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP 4 种脱氧核苷酸。.5蛋白酶 K:浓度为 10 mg/ml。.6 引物本试验选用SSrRNA基因序列作为PCR扩增区，设计两条引物P1、P2，引物位置和序列如下：P1(428～457)5′-TTGGCATGGGGGCGACCTTCACCCTCGCCC-3P2(699~670)5′-CCAAAGTCAACCAACGGTACGACAGGGTCA-3P1、P2引物扩增片段为272bp。其他试剂实验用水按GB/T 6682中规定准备，Tris碱、EDTA、SDS、苯酚、NaCI、HC1、乙醚和乙醇等均为市售分析纯。器材和设备PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、凝胶成像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、组织匀浆器或研磨器、灭菌离心管、离心机等。操作方法.1样品采集与处理.1.1样品采集取发病或可疑动物外周 EDTA抗凝血 20 mI。2 SN/T 3485--20.1.2样品处理血液样品需离心取沉淀以去掉血浆蛋白，再用0.01