SN_T 4828-2017韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4828—2017韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验检测方法Quarantine protocol for antibodies against Wesselsbrol disease virus by HI2017-07-21 发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T 4828—2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘艳华、高志强、谷强、张伟、蒲静、乔彩霞、尹羿、汪琳、张利峰、凌凤俊。 SN/T 4828—2017韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验检测方法1范围本标准规定了进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的血凝抑制试验检测方法。本标准适用于进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的检测。2缩略语下列缩略语适用于本文件。PBS:磷酸盐缓冲盐水HA:血凝试验HI:血凝抑制试验HAU:血凝单位3设备、材料和试剂3.1设备3.1.1台式离心机。3.1.2振荡器。3.1.3 冰箱。3.1.4恒温箱。3.1.5微量可调移液器。3.2材料和试剂3.2.196 孔V型微量反应板。3.2.2含 0.4%卵清蛋白的pH 7.5PBS和含0.4%卵清蛋白的pH 5.7PBS,配制方法见附录 A。3.2.3阿氏（Alsevers)液，配制方法见附录 B的B.1。%鹅红细胞悬液，配制方法见B.2。3.2.5韦塞尔斯布朗病血凝抗原，阳性血清和阴性血清。3.3 被检血清无菌采集动物血液，凝固后离心分离血清，56℃灭活处理30min后，置于4℃或一20℃保存备用。被检血清须采用高岭土-鹅红细胞吸附法去除非特异性凝集素。按如下方法进行处理：0.1 ml.被检血清,加人0.4mLpH 7.5磷酸盐缓冲液,再加人0.5 mL 25%高岭土，充分振荡混合，室温作用20 min，然后1 000 r/min离心30 min 取上清,加人 25 μL0.5%鹅红细胞悬液，轻轻振荡，冰浴吸附 20 min，1000 r/min离心10 min，吸取上清，即为1：10稀释的被检血清。1 SN/T 4828--20174操作步骤4.1血凝试验(见表 1)4.1.1在微量反应板的每孔均加人 25 uL含0.4%卵清蛋白的 pH 7.5 PBS。4.1.2吸取25μuL韦塞尔斯布朗病血凝抗原加人第1孔，反复吹打混匀。4.1.3从第1孔吸取25uL液体加人第2孔，混匀后吸取25uL液体加人第3孔，如此对倍稀释至第11孔，第11孔混匀后吸弃25μl。4.1.4每孔加入 25 μL含 0.4%卵清蛋白的 pH 5.7PBS。4.1.5每孔加人50μL0.5%鹅红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）。4.1.6轻轻振荡混匀,在20℃～25℃下静置 60 min后观察结果。4.1.7血凝效价确定：对照孔（第12孔）红细胞应呈现明显的纽扣状沉淀于孔底。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪珠状流消，完全血凝（不流涧)的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝效价，代表1个血凝单位(HAU)。4.1.8根据4.1.7的结果，使用含0.4%卵清蛋白的pH7.5PBS配制4HAU的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为4HAU抗原的稀释倍数。例如表2抗原效价为24（1：16），4HAU抗原的稀释倍数为2²（1：4)。4.1.9将25uL含4个血凝单位的抗原用PBS做等量倍比稀释，使每孔（25 μL)含有 2HAU、1HAU、0.5HAU和0.25HAU，每孔补加25uLPBS,再加人50μL0.5%鹅红细胞悬液，判定血凝结果与预期结果是否相符合。2HAU、1HAU孔红细胞应出现完全凝集，0.5HAU孔红细胞应出现50%凝集，0.25HAU孔红细胞应不凝集。若不相符，应重新配制抗原，测定效价。表 1 血凝试验孔号步骤对照试验项目序号810H60.4%卵清蛋白的 pH 7.5X1乙#PBS/μL25-2525-2抗原倍比稀释/μL213门弃去250.4%卵清蛋白的pH 5.725252532525252525252PBS/μL505050505050500.5%鹅红细胞/μL505050L1在20 ℃～25 ℃下静置 60 min作用时间及温度条件判定举例64.2血凝抑制试验(见表2)4.2.1在微量反应板的每孔均加人25 μL含 0.4%卵清蛋白的 pH 5.7 PBS。4.2.2吸取25μαL已经处理1：10稀释的被检血清加入第1孔内，充分混匀后吸取25μL于第2孔内，如此对倍稀释至第10孔，混匀后吸弃25 μL。最后2孔不加血清，分别作抗原对照和空白对照。4.2.