SNT 2358-2009国境口岸炭疽芽胞杆菌荧光定量PCR检测方法.pdf

5中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2358—2009国境口岸炭疽芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法Detection with real-time PCR for anthrax at frontier port2010-01-16实施2009-07-07发布3中华人民共和国发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2358—2009言前本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国河北出人境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所。本标准主要起草人：王林、韩伟、周蕾、崔鹰、张乐、史玲莉、张顺合、闫冀焕、孙肖红、李伟、王静、胡孔新。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2358-2009国境口岸炭疽芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法1范围本标准规定了出人境口岸炭疽芽孢杆菌的样品采集、处理、检测程序、阳性结果报告和处置。本标准适用于出人境口岸的炭疽芽孢杆菌检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。SN/T1214—2003国境口岸处理炭疽杆菌污染可疑物品操作规程WS233—2002微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3 对象3.1检测对象为国境口岸被炭疽芽孢杆菌污染或有被污染嫌疑的可疑物品。3.2炭疽芽孢杆菌污染可疑物品的判定按SN/T1214—2003中第3章规定进行。4生物安全要求4.1样品的处理与检测应在生物安全二级实验室(BSL-2)中进行4.2实验过程中的个体防护按WS233—2002中6.2.1和第A.2章规定进行。4.3采样与检测过程中所有可能受污染的物品应彻底消毒处理。5设备和材料5.1离心机：最高转速10000r/min或以上。5.2荧光定量PCR仪。5.3微量离心管:1.5 mL。5.4灭菌玻璃粉。5.5采样工具：按 SN/T1214--2003中4.2规定。5.6 PCR通用试剂。5.7 SYBR Green I核酸染料:1/500。5.8无菌去离子水。6样品的采集与处理6.1采样注意事项至少有两名经过培训的专业人员；按SN/T1214一2003中附录A采取个人防护措施，在准备好采样工具及消毒剂后，方可进人现场采样；可疑物品数量较多时，采集其中部分样品后，其余应立即就地封存。封存方法可选用由防水的 SN/T 2358--2009轻型材料制成的挡板隔离污染区域，所有污染区域应严格密封，污染区的通风口应由塑料罩密封，以控制尘埃传播和循环流动的危险；样品包装应始终保持密封状态；采样用的棉签、拭子等均应一次性使用，样品应收集在密闭的一次性无菌容器中，避免样品间的交叉污染;一样本采集过程中特别注意防止污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等：一采样完毕后，应彻底消毒，避免可疑物扩散；采样箱移出污染区前，应对其表面进行消毒。6.2采样程序6.2.1易剪取的物品（如：食品、动植物样品等)可按无菌技术操作，剪取小块样品置于无菌容器中密封保存。6.2.2粉末状物品（如：白色粉末土壤等）可按无菌技术操作：用采样勺挑取一定量样品置于无菌容器中密封保存。6.2.3液体样品（如：水、饮料等)可按无菌技术操你，吸取一定量液体置于无菌容器中密封保存。6.2.4其他不易采集的物品（如：信件或其他物体表面）可用无菌拭子采样，按SN/T1214-2003中附录 B第 B.3章操作。6.3样品处理6.3.1小块样品取0.25g剪碎，加人0.5ml无菌生理盐水；振荡混匀，自然沉淀10min，取上清液备用。.i...6.3.2粉末状样品取0.25g，直接加人,0.5mL无菌生理盐水；振荡混匀，自然沉淀10min，取上清液备用。6.3.3液体样品不需特殊处理，可直接用于DNA模板制备：6.3.4采集的拭子用0.5mL无菌生理盐水洗涤/，自然沉淀10min，取上清液备用。7DNA模板制备7.1裂解：向每200μL上清液或液体样品中加天6.mlol/L碘化钠（NaI)100μL，振荡混匀30 s，煮沸30 min,其间每5 min 振摇1次。7.2DNA吸附：将上述煮沸处理的样品于160001/mhin离心5min,将上清液转至另一含20%玻璃粉悬液5μL的微量离心管中，充分混匀，置室温10min/其间每2min混匀1次，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上，8000 r/min离心2min，小心倾去上清液。7.3洗涤：向玻璃粉DNA沉淀中加入75%乙醇1mL，充分混匀，洗涤玻璃粉，8000r/min离心2min，小心倾去上清液，重复洗1次，