SN 1569-2005进出口河豚中河豚毒素检验方法 ELISA法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1569—2005进出口河豚中河豚毒素检验方法ELISA 法Inspection of tetrodotoxin in puffer fish for import and export--ELISA method2005-05-20发布2005-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1569—2005前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴斌、秦成、于杰、王刚、赵守成、王玫、宋慧君。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I SN/T 1569--2005进出口河豚中河豚毒素检验方法ELISA 法范围1本标准规定了进出口河豚中河豚毒素检验的抽样、制样和酶联免疫吸附检测方法。本标准适用于进出口河豚鱼肉、皮、肝、生殖器中河豚毒素的检测。2缩略语TTX Tetrodotoxin 河豚毒素ELISAEnzyme Linked Immunosorbent Assay酶联免疫吸附法A值Absorption value　吸光度值牛白蛋白-甲醛-BAS-HCHO- TTX Bovine Serum Albumin-HCHO- Tetrodotoxin conjugate河豚毒素连接物PBS-T Phosphate Buffered Saline-Tween 磷酸盐吐温-20 洗液McAb-HRPMonoclonal Antibody-Horseradish Peroxidase单克隆抗体辣根过氧化物酶标记物3抽样3.1检验批以同一海区、同一产地、同一养殖场的河豚为一检验批，同一检验批的商品应具有相同特征，如品种、包装、标记、产地、规格等。3.2抽样数量根据各检验批的质量及件数，按表1确定抽样件数。如为散装的应均匀抽样。表1抽样数量的确定批量抽样数量箱(件)箱(件)kg2 ~252 50~5003501~1 20026~ 60461~~1601 201~3 2007161~5003 201~10～1 75010 001 ~~ 35 000161750以上35 000 以上3.3抽样方法按3.2规定的抽样箱数随机抽取，逐件开启。对整体鱼每箱至少扦取完整个体3条作为原始样品，并详细记录扦取样品的特征（体色、斑纹、规格、体长、体重、有无刺等），装人盛样器内；成品或半成品样品扦取的每个小样不得少于200g。加封后，标记。0℃～5℃条件下48h内送达实验室。3.4样品的保存如实验室不能立即检验，应分别用标签注明来源、取样日期、品种及编号，装塑料袋密封。抽样后样品应立即于一18℃以下冷冻保存。 SN/T 1569--20054测定方法4.1方法原理抗-TTX酶标记物与样品中的 TTX 及酶标板上包被的 TTX 发生免疫竞争反应,样品中的 TTX浓度与吸光度值成反比，按绘制的校正曲线定量计算样品中的TTX浓度。4.2方法提要用牛白蛋白-甲醛-河豚毒素连接物（BSA-HCHO-TTX)溶液包被酶标微孔板，然后加入不同浓度的TTX标准溶液（制作校正曲线）或样品提取液（检测样品）与单克隆抗体辣根过氧化物酶标记物（McAb-HRP)的混合液，再加入底物液，显色，加人终止液，于490 nm处测定A值，根据A值得出样品中河豚毒素的含量。4.3试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。4.3.1乙酸缓冲液：pH=4.8(按附录A配制）。4.3.2磷酸盐缓冲液(PBS):pH一7.2,0.05mol/L(按附录A配制)。4.3.3底物缓冲液：柠檬酸-磷酸盐缓冲液(按附录A配制）。4.3.4 洗液(PBS-T):含 0.5%吐温-20的 0.05 mol/L PBS(按附录 A 配制)。4.3.5 McAb-HRP:Sigma 公司生产。4.3.6OPD底物液：按附录A配制。4.3.7过氧化氢溶液：0.5mol/L。4.3.8终止液:2 mol/L硫酸。4.3.9 BSA-HCHO-TTX:Sigma 公司生产。4.3.10氢氧化钠溶液：1 mol/L。4.4仪器和设备4.4.1酶标分光光度仪。4.4.296孔酶标板。4.4.3均质器。4.4.4天平：感量为0.1mg。4.4.5 冰箱:0～5℃和-15℃～-20℃。4.4.6培养箱：37℃±1℃。4.4.7减压过滤装置。4.5测定步骤4.5.1试样制备冷冻样品装于密封的塑料袋内于流水下急速解冻，整体鱼用蒸馏水清洗后，用滤纸吸干，然后将鱼体分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢（雄性为精束)等部分，用蒸馏水洗去血污，再用滤纸吸于、称量，分别将解剖后取得的样品剪碎，充分均质。冷冻的成品或半成品样品装