SN_T 4824-2017牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4824—2017牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法Detection method for Akabane virus of bovine and ovine by LAMP2017-07-21 发布2018-03-01 实施中华人民共和国0发布国家质量监督检验检疫总局W315森摩 SN/T 4824—2017前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、华南农业大学。本标准主要起草人：鱼海琼、蔡先全、程珏益、贾坤、赵吟、王莹、田纯见、陈芳、陈茹、林志雄。 SN/T 4824--2017牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法范围1本标准规定了牛、羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法。本标准适用于牛、羊赤羽病病毒核酸现场快速初筛检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 18088出人境动物检疫采样3缩略语下列缩略语适用于本文件。AKAV赤羽病病毒（Akabane virus）LAMP环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification)赤羽病概况4赤羽病病毒为单股RNA病毒，属布尼病毒科布尼病毒属，由其引发的赤羽病概况参见附录 A。5 试剂5.1RNA抽提试剂盒。5.2Bst DNA 聚合酶。5.3Betaine 甜菜碱。5.40.01 mol/L PBS缓冲液（见附录 B)。5.510XThermopol 缓冲液。5.6100 mmol/L MgSO4 .5.710 mmol/L dNTP。5.85 X AMV Buffer 及 AMV RTase.5.9AKAV细胞培养物（灭活）。5.10内引物(FIP+BIP)。5.11外引物（F3+B3）。5.12RNasin. SN/T 4824—20176设备与材料6.1冷冻离心机。6.2恒温水浴箱。6.3生物安全柜。6.4移液器。7 原理根据AKAV特异性S基因6个特异区域设计两对引物，在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，由4条引物识别靶序列上的6个特定区域（参见C.1），在63℃左右对核酸进行等温扩增。扩增产物加人染料后阳性孔会出现肉眼可见的绿色。8操作步骤8.1引物序列参见 C.2。8.2样品的采集与前处理8.2.1总则采样参照GB/T18088进行。采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴手套，在具备相应生物安全条件的区域内按照生物安全要求进行操作。8.2.2死胎或组织样品用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中或超声裂解仪器中充分研磨裂解，再加5.0mLPBS混匀，然后将组织悬液转人无菌1.5mL离心管中，离心取上清，编号备用。8.2.3血液用无菌注射器直接吸取200μL～500μI血液至无菌1.5mL离心管中，抗凝，编号备用。8.2.4存放与运送采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存不超过24h；若需长期保存，须放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，冷链运送到实验室。8.3扩增试剂准备与配制8.3.1核酸提取移取200 μL正常细胞培养物作为阴性对照，移取等量DEPC水作为空白对照。将 200 uL处理好的待检样品移至1.5mL离心管中。最后移取经过灭活处理的AKAV细胞培养液至另外的1.5mL离心管中作为阳性对照，按照核酸提取试剂盒要求提取病毒RNA。2 SN/T 4824—20178.3.2cDNA模板的制备将8.3.1中提取的RNA按照表1所列反转录体系加人各成分，总体积为20μul，混匀后置于 42℃水浴1h，反应产物置于一20℃保存或立即进行扩增。表 1 反转录体系试剂体积(浓度)5 X AMV Buffer4 μLdNTPs2 μL.(10 pmol/μL)随机引物1 μL(30 pmol/μL)RNasin1 μL(20U)提取的 RNA11.5 μLAMV RTase1 μL(5U)8.4扩增加样记录样本摆放顺序，按表2所示体系加样，最后加对应浓度的引物和模板。按照空白对照、阴性对照、被检样品、阳性对照的顺序依次加样。也可直接选取商品化LAMP反应试剂盒，按照试剂盒要求添加各项组分（包括染料)及设置反应条件。表2LAMP反应体系RT-LAMP反应液组分体积（反应）/μ10 X Thermopol Buffer2.5dNTP(10 mmol/L)2.5MgSO, (100 mmol/L)2FIP-+BIP(40 μmol/1)0.5F3+B3(10 μmol/L)0.5Bet