SN_T 4874-2017葡萄金黄化植原体检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4874—2017葡萄金黄化植原体检疫鉴定方法Detection and identification of Grapevine flavescence doree phytoplasma2017-07-21 发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T 4874-2017前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国二连浩特出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王有福、李鑫、张永宏、曹冬梅、姜一、胡强、刘卉秋、王秀芬、徐凤敏。 SN/T 4874—2017葡萄金黄化植原体检疫鉴定方法1范围本标准规定了葡萄金黄化植原体的检疫和鉴定方法。本标准适用于进境葡萄及其繁殖材料中葡萄金黄化植原体的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1157进出境植物苗木检疫规程3葡萄金黄化植原体基本信息中文名：葡萄金黄化植原体英文名:Grapevine flavescence dorée phytoplasma分类地位：软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体目（Achoieplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma），16SrV植原体组。葡萄金黄化植原体的其他信息参见附录A。4　方法原理葡萄金黄化植原体生物学特性和基因特性作为本标准鉴定方法的主要依据。以组织材料症状观察、DAPI染色的形态学为初步筛查方法；以植原体核糖体 16S rDNA序列特征为主要的判定依据。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备定性PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、台式冷冻离心机、纯水仪、台式小型离心机、冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、水浴锅、凝胶成像系统等。5.2 主要试剂除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双蒸水。其他试剂比如各种溶液、缓冲液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录B要求准备。商品化试剂参见其使用说明。植物 DNA 提取试剂盒、PCR Premix、超纯水、DNA marker 及 DNA提取试剂等。核酸提取研磨液（100 mL):K²HPO4·3H²O，2.17 g;KH2PO4，0.41 g；蔗糖，10 g;BSA(Fraction V),0.15 g;PVP-10,2 g。pH7.6 高温灭菌,4 ℃保存。1 SN/T 4874—2017DNA 提取液:Tris-HCl,100 mmol/L;EDTA,100 mmol/L;NaCl,250 mmol/L;调 pH 至 8.0。50XTAE:2.0 mol/L Tris,1.0 mol/L NaAc,50 mmol/L EDTA,pH 8.0.DAPI:4’,6-二基-2-苯基吲哚。6检测鉴定方法6.1 症状观察6.1.1现场查验现场对葡萄苗木进行观察，症状描述参见附录A，选取可疑症状（参见附录A)植株样品和随机样品（具体取样方法见SN/T1157)带回实验室检测。6.1.2 DAPI 染色选取幼嫩组织（新叶叶梗、枝梢、茎秆及根部韧皮部组织），切片，用1ug/mLDAPI溶液（4，6-二基-2-苯基吲哚)染色，在460 nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。6.2DNA 提取取所选新鲜材料的韧皮部及叶中脉0.3g，或干材料0.1g，取适量液氮研磨，再加入研磨液2ml充分研磨，4 ℃ 12 000 r/min 离心 20 min，弃上清液。加人 500 μL DNA 提取液，20 μL 蛋白酶K（5mg/mL),轻轻混匀，加人 80 μL 10%十二烷肌氨酸钠，混匀，在 55℃温育1 h～2 h，4℃6 000r/min，10 min,取上清液。加人2/3体积异丙醇到上清液中，轻混匀，一20 ℃保持至少30 min，4 ℃ 12 000 r/min，15 min，弃上清液。加人600 uLTE 缓 冲液，30 μL SDS，12 μL蛋白酶K(5 mg/mL),混匀,37 ℃温育 30 min～60 min。加 100 μL5 mol/L NaCl 混匀,再加人 84 μL CTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育10 min。加入等体积三氯甲烷：异