WST 22-1996血中游离原卟啉的荧光光度测定方法.pdf

中华人民共和国卫生行业标准血中游离原吓琳的荧光光度测定方法WS/T 22-1996Blood-Determination of free erythrocyteprotoporphyrin-Fluorometric method1主题内容与适用范围本标准规定了血中游离原外啉的荧光光度测定方法。最低检测浓度为5μg/100mL。本标准适用于正常人和接触铅的工人血液中游离原吓啉的测定。2原理用乙酸乙酯-乙酸混合液破坏红细胞，使原吓啉溶出，再用盐酸萃取此溶液中的游离原卧啉，在激发光403nm，发射光605nm处显示其荧光谱峰，根据荧光强度进行定量。3仪器3.1930型荧光光度计，10mm荧光比色杯。3.2旋涡混合器。3.3离心机。3.41/10万天平。3.5刻度吸量管，1,2,5，10mL。3.6血红蛋白吸管。3.7试管，10mL，具塞。3.8微型称量瓶。3.9容量瓶，25mL,50mL。3.10水泵。4 试剂本标准所用试剂除另有说明者外，均为分析纯试剂。4.1实验用水：蒸馏水，或具有同等纯度的去离子水。4.2 盐酸,P20o=1.19 g/mL。4.3乙酸乙酯-乙酸混合液（4十1）。4.4盐酸溶液，0.5mol/L。4.5生理盐水，氯化钠8.5g/L。4.6硅藻土生理盐水悬浮液，25g/L。4.7原叭啉标准溶液：4.7.1储备液：用十万分之一的天平精确称取1.25mg原叶啉，加浓盐酸约2.5mL，待原叶啉溶解后，转入25mL容量瓶中，用重蒸水淋洗称量瓶，并入容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液1mL=50μg原叶啉（如为原叶啉钠盐或原叶啉二甲基酯则分别应称取1.35mg和1.28mg）。中华人民共和国卫生部1996-10-14批准1997-05-01实施 WS/T 22-19964.7.2应用液：取储备液0.1mL置50mL容量瓶中，用乙酸乙酯-乙酸混合液稀释至刻度。此溶液1mL=0.1μg原吓啉。4.8质控样：用标准血样、接触者混合血样或加标血样作质控样。5采样、运输和保存取末梢血20uL，直接注入到有0.1mL生理盐水（4.5)的试管内，加塞，混匀，置冰瓶中运送，于4℃冰箱内保存。6分析步骤6.1仪器操作条件选用42#（581光电比色计滤光片，420nm）为激发光滤光片和55#（550士10nm）荧光滤光片。6.2标准曲线的绘制6.2.1取6支10mL具塞试管，按下表配制标准管。FEP标准管的配制501234管号0. 1 0. 10. 10. 10. 10. 1生理盐水（4.5），mL0. 71. 000. 10. 30. 5原吓啉标准应用液（4.7.2），mL00. 31. 00. 90. 70. 5乙酸乙酯-乙酸混合液（4.3），mL0. 050. 070.1000. 010.03FEP含量，μg6.2.2各管混合均匀后，各加0.15mL2.5%硅藻土悬浮液（4.6)，3mL乙酸乙酯-乙酸混合液（4.3)。6.2.3各管分别置旋涡混合器上混合10～15s（或振荡30s）后，于2000r/min离心15min，将上清液分别倒入另清洁的10mL具塞试管中，各加4mL0.5mol/L盐酸（4.4），加塞，于旋涡混合器上混合20～30s（或振荡3min），待分层后，用水泵（或毛细吸管）吸去上层有机溶剂，取下层盐酸溶液于荧光光度计上以零管作参比进行荧光强度测定。6.2.4以FEP含量为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。6.3样品测定将血样从冰箱中取出，摇匀，加1.0mL乙酸乙酯-乙酸混合液（4.3），以下步骤按6.2.2和6.2.3条操作，从标准曲线上查出血样中FEP含量。在测定前后及每测定10个样品后，作一次质控样测定。7 计算按下式计算血中FEP的浓度：X=×1 000式中：X——血中FEP的浓度,μg/L;-由标准曲线上查出血样中FEP含量，ug；mV—分析时所取血样量，mL。8说明8.1本标准的最低检测浓度为5μg/100mL血；测定范围0.001~0.1μgFEP/20μL；批间精密度CV=4.3%~7.0%，批内精密度CV=2.4%~5.3%(FEP范围0.01~0.1μg，n=6)；准确度：血样加标平均回收率为96.6%（加标浓度：0.03，0.05，0.07μg，n=6）。 WS/T 22-19968.22用荧光法测定血中FEP,经用正交试验进行最佳测定条件选择，得出最佳条件是：盐酸的浓度为0.5mol/L，乙酸乙酯-乙酸的比例为4十1，硅土悬浮液用量为0.15mL，振摇时间为5min，现改用旋涡混匀器可减少为20～30s。全过程在30min内完成。8.3本法与荧光分光光度法对比，96个样本测得结果的相关系数r=0.9796，tr=47.02,p0.001，提示相关系数有非常显著意义。但当血中FEP值低于20μg/1