SN_T 1226-2015禽痘检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1226-2015代替SN/T1226二2003SN/T 1557--2005禽痘检疫技术规范Quarantine protocol for fowlpox2015-09-01 实施2015-02-09 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局详市、刮涂层查真伪 SN/T 1226—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准主要依据是（0IE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2012)第2.3.10章节《禽痘》本标准代替SN/T1226-2003《禽痘抗体检测方法红细胞凝集抑制试验》和SN/T1557--2005《禽痘琼脂免疫扩散试验操作规程》。本标准与SN/T1226--2003和SN/T1557-2005相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：一增加了禽痘病毒分离及鉴定;--增加了抹片镜检;增加了荧光抗体试验;增加了聚合酶链式反应本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：林庆燕、曾少灵、陶虹、孙洁、秦智锋、唐金明、阮周曦、廖立珊、刘建利、卢体康、陈书琨、陈兵、胡运发。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1226-2003;SN/T 1557--2005。I SN/T 1226—2015禽痘检疫技术规范1范围本标准规定了禽痘检疫临床诊断、病毒分离与鉴定、抹片镜检、琼脂免疫扩散试验、荧光抗体试验、血凝抑制试验、聚合酶链式反应等的检疫技术要求。本标准适用于进出境禽痘的检疫、诊断与监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室‧生物安全通用要求3概述禽痘是由禽痘病毒（avian poxvirus,fowlpox virus)引起禽类的一种急性、高度接触传染病，禽痘病毒属于痘病毒科（poxviridae)禽痘病毒属（avipoxvirus）。禽痘病毒的自然宿主是鸡和火鸡，其他禽类易感性较低,四季都可发生。禽痘的潜伏期一般为 4 d～14 d,病程通常为 3 w～4 W。根据症状、病变以及病毒侵害禽体部位的不同，分为皮肤型、白喉型、混合型，偶有败血型的发生。4诊断技术4.1临床综合诊断禽痘发生的痘疹可出现在皮肤、口腔和咽喉部的黏膜，如冠、肉垂、嘴角、眼皮、耳球和腿、脚、泄殖腔及翅的内侧等，形成特殊的痘疹。痘疹最初为灰白色细小点，随后增大成豌豆大小、灰色或灰黄色的结节，数目较多时可连结成痴块。眼部痘痴可使眼缝完全闭合，口角痘痴则影响家禽采食，可作为初步诊断依据。4.2 病毒分离与鉴定4.2.1设备、材料和试剂设备超净工作台、台式离心机、冰箱、孵化箱、照蛋器、恒温水浴锅、倒置显微镜、微量可调移液器、恒温恒湿培养箱。材料和试剂打孔器、酒精灯、电烙铁或针头、胶带、1.0mL一次性灭菌注射器、洗耳球（或助吸器）、弯头玻璃吸管、75 cm²细胞培养瓶、移液管、9d～12d的SPF 鸡胚、5%石碳酸、pH 7.20.01mol/I. PBS(配制方法 SN/T 1226—2015见附录A）、碘酒或75%酒精、MEM培养基、胎牛血清、抗生素储备液（青霉素10000IU/mI，链霉素10000μg/ml，可直接购买商业抗生素浓缩液）。4.2.2样品采集与制备用剪刀与镊子插人病变组织内，采集新出现的病变组织2.0g以上，放人研钵中充分研磨，加5mlpH 7.20.01 mol/L PBS溶液（含青霉素 100 IU/mL，链霉素 100 μg/mI)混匀，将组织悬液转人无菌10 mL离心管中，以3000 r/min离心10 min，吸取上清液转人无菌1.5 mI离心管中，编号备用。样品应尽快处理，可在4℃保存4d,如要保存更长时间，需保存于一80℃条件下。4.2.3鸡胚分离选择 9 d～12 d的 SPF鸡胚，用5%石碳酸进行表面消毒。在照蛋器上观察，选择鸡胚血管较少的一侧，用电烙铁在卵壳上烙一个烤焦圈，或用自制针头(无针尖)沿定位线钻一个直径5mm的圆圈，但不能钻透壳膜。用刀片挑起一小片卵壳。另外，在气室上方用针头钻穿一个孔。用橡皮吸球从气室上的小孔轻吸气，使胚内形成负压，使侧面开口处的绒毛尿囊膜下陷。从侧面的开口，用注射器通过壳膜插人约5mm深，将0.1mL的样品滴在下陷的绒毛尿囊膜上。缓慢抽出针头，用胶带将蛋壳上的两个孔全部封住。将气室端向上，鸡胚于37℃孵化箱内孵育（见图1)。YEC8人工气室CRS:一吸气+.图 1尿囊膜接种法每日观察接种的鸡胚,弃掉 24 h内死亡的鸡胚。第6 d～