SN_T 3306.4-2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第4部分：嗜肺军团菌.pdf

1-1中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3306.4—2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMIP）检测方法第4部分：嗜肺军团菌Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 4 :Legionella2012-12-12 发布2013-07-01实施中华人民共和国()发布国家质量监督检验检疫总局涂层鑫真伪 SN/T 3306.4--2012前言SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》共分为4部分：第1部分：鼠疫杆菌；第2部分：产毒素霍乱弧菌；第3部分：志贺氏菌；第 4 部分嗜肺军团菌。本部分为SN/T3306的第4部分。本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、正元盛邦（天津)生物科技有限公司。本部分主要起草人：左锋、鞠文东、陆晔、柴宏森、刘涛、祁军、谭绪良、张靖。 SN/T 3306.4--2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第4部分：肺军团菌1 范围SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测环境水样品中嗜肺军团菌的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。本部分适用于国境口岸嗜肺军团菌的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求WS/T 230--2002临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用SN/T 2528　饮用水中军团菌检测3缩略语下列缩略语适用于本文件。Betaine:甜菜碱Bst 酶[Bst DNA polymerase(large fragment)］:Bst DNA 聚合酶(大片段)DNA(deoxyribonucleic acid）:脱氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate)：脱氧核苷三磷酸EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid):乙二胺四乙酸LAMP(loop-mediated isothermal amplification):环介导恒温扩增Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，保证试验的顺利进行，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测嗜肺军团菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。5防污染措施防止污染措施应符合WS/T230的规定。6技术概要根据嗜肺军团菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，或再增加环状引物一对，特11 SN/T 3306.4—2012异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst 酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。7试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1引物：根据嗜肺军团菌特有的靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1,外引物2,内引物1，内引物2和环状引物1,环状引物2.。外引物 1(F3,5-3):AAG ATG AAA TTG GTG ACT GCA GC外引物 2(B3,5-3):AGC AGT ACG TTT TGC CAT CA内引物 1(FIP,5-3):TCG GCA CCA.ATG CTA TAA GAC AAC TAA TGT CAA CAG CAATGG CTG C内引物 2(BIP,5-3):GGC TAA AGG CAT GCA AGA CGT TTC TGA AAC TTG TTAAGA ACG环状引物 1(LF,5′-3):CCG ,ATG CCA CAT CAT TAG CTA CAG ACA环状引物 2(LB,5-3):TTG GCT TTA ACC GAA CAG CA 7.2 DNA 提取液:含 20 mmol/Il Tris-HCl(pH8. 0)、2 mmol/L EDTA 和 1.2% Triton X-100。7.3 dNTP:10 mmol/L.7.4 Bst 酶:8 U/