SN_T 3754-2013松干基褐腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3754—2013松干基褐腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phellinus weirii(Murrill)R.L.Gilbertsons2014-06-01实施2013-11-06 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T3754—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国苏州出入境检验检疫局、中华人民共和国南京出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴翠萍、焦彬彬、陈云芳、张勇、粟寒、李彬、杨静、王振华、安榆林。I SN/T 3754—2013松干基褐腐病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了进出境针叶树中松干基褐腐病菌的分离培养及分子生物学鉴定等方法。本标准适用于对来自松干基褐腐病发生国家和地区的苗木、原木、木制品（含木质包装、铺垫材料）等所有寄主植物中松干基褐腐病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅注且期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T1126进出境木材检疫规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1刚毛状菌丝 setal hyphae在菌肉或菌髓中形态像菌丝，但明显比菌丝宽，且具有厚壁，顶端尖锐的结构。3.2生殖菌丝generativehyphae担子果中基本的菌丝类型。在刺革菌科（Hymenochaetaceae）种类中，生殖菌丝只形成简单分隔，不形成锁状联合，通常无色、浅黄色或浅黄褐色，薄壁或厚壁，分枝或很少分枝。3.3襄状体cysttidium囊状体生在担子间，它们的起源多数如同担子，分布在菌褶的整个表面，因为它着生位置不同，又给以不同名称。生在菌褶两侧的叫囊状体。3.4次生菌丝secondaryhyphae次生菌丝是一种具有分枝状的菌丝，一般由担子菌中异性的初生菌丝进行体细胞接合而形成的菌丝。4病菌基本信息中文名：松于基褐腐病菌学名：Phellinus weirii(Murrill)R.L.Gilbertsons异名：Inonotus weirii,Poria weirii,Fomitiporia weiri分类地位：真菌界（Fungi），担子菌门（Basidiomycota），担子菌纲（Basidiomycetes），刺革菌目1 SN/T3754—2013（Hymenochaetales），刺革菌科（Hymenochaetaceae），木层孔菌属（Phellinus）。传播途径：该病菌主要通过原木、苗木、接穗以及各种无性繁殖材料进行远距离传播。该病原菌根据寄主的差异，分为花旗松型（theDouglas-firform）和雪松型（theredcedarform），两型的主要区别在于：花旗松型的子实体为一年生，在培养基上的颜色较浅，寄主范围包含了花旗松等在内的一些针叶树；雪松型的子实体为多年生，在培养基上的颜色较深，寄主范围窄，仅侵染雪松。两者的病原形态没有明显的区别。5方法原理根据松于基褐腐病菌在寄主上的症状特征针对病原菌进行分离与培养，根据病原菌DVA通用弓物PCP-RFLP和特异性引物PCR检测结果进行综合判定。6仪器设备和主要试剂6.1仪器设备PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、生物培养箱、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电热恒温水浴、电泳仪、凝胶成像系统：6.2用具斧头、手持放大镜、灭菌培养皿、镊子、手术剪、手术刀、酒精灯、载玻片、盖玻片等。6.3主要试剂和培养基PCR缓冲液、dNTPs(dATP、diTTP、dGTP、dGTP）、TαINA聚合酶、DNA提取试剂盒、马铃葡萄糖琼脂培养基（PDA）、引物（由生物试剂公司合成）7现场检疫按SN/T1126、SN/T1157结合症状检查进行抽样。挑可疑症状的样品（参见A.4），送实验室作进一步检疫鉴定。8实验室检疫8.1病原菌的分离培养将带病木段用自来水冲洗于净并用吸水纸吸于。用消毒的解剖刀片将表面部分去除，放人无菌的密封塑料袋内，袋内以无菌湿棉球保湿，置于22℃～27℃培养箱内12h光暗交替培养。每天取出于解剖镜下观察，长出菌丝后将之分割成约3mm×3mm×6mm小块，置于PDA培养基平板上，每个培养血放置5块，27℃黑暗培养。3d后开始观察。解剖镜下发现有白色菌丝长出，立即挑取菌