NY 575-2002牛传染性鼻气管炎诊断技术.pdf

ICS 11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 575—2002牛传染性鼻气管炎诊断技术Diagnostic techniques for infectious bovine rhinotracheitis2002-08- 27 发布2002~12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 575--2002前言牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotracheitis，简称 IBR）是由牛疱疹病毒1型（BHV-1）感染家养牛和野生牛引起的一种病毒性传染病，被世界动物卫生组织[World Organization for AnimalHealth（英），Office International des Epizooties（法），OIE］列为B类疾病，我国农业部列为二类动物疫病。该病广泛分布于世界各地，该病死亡率较低，许多感染牛呈亚临床症状经过，往往由于细菌继发感染导致更为严重的呼吸道疾病。本标准所规定的技术与OIE推荐的相应技术一致。本标准的附录A,附录B为规范性附录。本标由农业部畜牧兽医局提出。本标由全国动物检疫标推化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标准主要起草人：封启民、李昌琳、李晓成、李其平。 NY/T 575—2002牛传染性鼻气管炎诊断技术1范围本标推规定了牛传染性鼻气管炎（IBR)诊断技术要求。本标准规定的病毒分离方法适用于牛传染性鼻气管炎病毒的分离;微量血清中和试验和酶联免疫吸附试验适用于牛群检疫、流行病学调查及牛群抗体水平的检测。2 牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定2.1材料准备2.1.1病料的采集2.1.1.1呼吸道拭子：用灭菌拭子伸人鼻道采取分泌物，然后放人含青霉素1000IU/mL，链霉素1000 ug/mL，pH7.2的Earles液中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，并用相同的方法处理。2.1.1.2阴道拭子：用棉拭子采集脓疱性外阴阴道炎早期病变的阴道黏液，放人含青霉素1 000 IU/mL,链霉素1 000 μg/mL,pH7.2 的 Earles 液中。2.1.1.3脑组织样品：在剖检时无菌采集脑组织。2.1.1.4流产胎儿组织样品：刚死亡的胎儿，无菌采集肺、肾、脾等各种组织样品，放人每1.0mL含有1 000 IU 青霉素,1 000 μg链霉素，pH7.2的 Earles 液中。2.1.1.5精液：至少采集新鲜精液，或冷冻精液0.5mL，置液氮中保存备用。2.1.2样品的运送采集的样品立即放入4℃冰箱保存，在24h内送到实验室。2.1.3样品处理2.1.3.1收到棉拭子样品后，先经冻融两次，并充分振动，拧干棉拭子，将样品液经10000r/min离心10 min，取上清液作为组织培养的接种分离材料。2.1.3.2组织样品先用Earles液或Hanks液（pH7.2)制成20%的勾浆悬浮液，再经10000r/min离心10min，取上清液作为接种分离材料。2.1.3.3精液冻融两次或超声波裂解，再经10000r/min离心10min，新鲜精液通常对细胞有毒性，在接种前应预先作稀释处理，用Earles 液作1：15稀释。2.2操作方法样品接种：取经处理过的样品0.2mL接种到已形成良好单层的牛肾或睾丸原代或次代细胞培养瓶中。每份样品接种4瓶，于37℃吸附1h后，倾去接种液，用Earles液洗三次，最后加人含3%（不含IBR 抗体)的犊牛血清细胞维持液 1 mL。置 37℃培养,逐日观察细胞病变;若 7天仍不出现致细胞病变。则收获培养物继代于新制备的细胞上，盲传三代后，观察细胞病变，出现病变者收获培养物，保存于一70℃待鉴定。2.3 病毒鉴定病毒致细胞病变特点是细胞变圆，聚合，呈葡萄串状、拉网状，最后脱落。取出现上述病变的细胞培养物，经冻融、裂解两次后，以10 000r /min 离心10 min，取上清再作下列试验。1 NY/T 575—20022.3. 1 组织培养感染剂量(TCID50)的测定按Reed-Muench 方法测定，计算分离物 TCIDso终点。2.3.2分离物作血清中和试验用IBR标推阳性血清(效价 1：32 以上)和阴性血清分别与该分离物作中和试验(固定血清-稀释病毒法）按Reed-Muench法分别计算TCIDs0。如分离物引起典型的 IBR 细胞病变,并且经血清中和试验,其阳性血清组和阴性血清组的 TCIDs0对数之差≥2.5,则判该分离物为 IBR 病毒。3微量血清中和试验3.1材料准备3.1.1器材灭菌的96孔细胞培养板，50μL、100μL、300μL微量移液器，灭菌的塑料滴头，无毒透明胶带（其宽度与培养板一致），灭菌的塑料锥形带盖离心管，倒置显微镜。3.1.2试验材料IBR Baitha-Nu/67 弱毒株