SN 1558-2005禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1558—2005禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验操作规程Protocol of agar gel immunodiffusion test for avian encephalomyelitis2005-02-17 发布2005-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局“数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行准业标禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验操作规程SN/T 1558—2005*中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www.bzcbs. com电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张 0.5字数９千字2005年5月第一版2005年5月第一次印刷*如有印装差错由本社发行中心调换版权专有1侵权必究举报电话：（010SN/T 1558-2005:前言本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：秦智锋、卢体康、李环玲、本标准是首次发布的出入境检验检疫行业标准。- SN/T 1558—2005禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验操作规程1 范围本标准规定了禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验操作方法。本标准适用于禽脑脊髓炎病毒抗体的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696：1987)3器材与试剂3.1器材3.1.1 平m:平皿直径为 90 mm。3.1.2微量加样器。3.1.3塑料吸头。3.1.4打孔器：内径4.0mm，孔间距3.0mm，7孔梅花样金属打孔器。3. 2试剂3.2.11禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验抗原和标准阳性血清。3.2.2 琼脂糖。3.3溶液配制pH 7.20.01mol/L磷酸盐缓冲溶液及1%硫柳汞溶液配制方法见附录A,试剂配制用水需满足GB/T6682的要求。3.4被检血清无菌条件下静脉采血1mL左右,将血样进行血清分离后，保存于 4℃待检，若需长期保存，则置于-20℃冰箱。4操作步骤4.1琼脂板制备称取琼脂糖1.0g,加pH 7.20.01mol/L磷酸盐缓冲溶液至100mL。加热融化后，加人8.0g氯化钠，充分溶解后，加人1.0mL1%硫柳汞溶液（终浓度为0.01%）。冷却至45℃～50℃，将洁净干燥、直径为90mm的灭菌平皿，放置于水平平台上，每个平Ⅲ加18 ml,厚度约为 3.0 mm。凝固后盖严,把平血倒置放人4℃冰箱中保存备用。4.2打孔反应孔现用现打。从冰箱内取出琼脂板，用7孔一组的梅花形打孔器进行打孔（中间1孔，外周6孔）（见图1），孔径4.0mm，孔距3.0mm。将孔中的琼脂糖轻轻挑出或吸出，勿伤及边缘或使琼脂层脱离玻璃。平血中各孔排列见图2。1 SN/T 1 平Ⅲ中梅花形7孔一组排列示意图(O00%O0OCO0C0OO0图 2 90 mm平血中三组梅花形孔排列示意图4.3封底在酒精灯火焰上通过4次～6次加热平皿背面，使底部琼脂稍微融化。4.4加样结合上列图示，用微量加样器吸取抗原溶液滴入中央孔，标“十”的三孔加标准阳性血清，1、2、3孔加被检血清，每孔均需加满，但不能溢出。每加二个被检样品应换一个吸头。4.5反应加样完毕，室温静置10min，放人保湿盒内置22℃～26℃反应，分别在24h、48h和72h观察并记录结果。5 结果判定5. 1 判定前提将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，在抗原孔与标准阳性血清孔之间出现一条清晰、致密的沉淀线，抗原孔与阴性血清孔之间不出现沉淀线，说明对照成立，可进行结果判定。5.2 阳性抗原孔与被检血清孔之间形成的沉淀线与阳性对照血清形成的沉淀线弯曲环联，判为阳性（见图3)。注：标十”孔为标准阳性血清，1、2、3孔被检血清呈阳性。图3 被检血清呈阳性示意图2 SN/T 1558—20055.3可疑若抗原孔与被检血清孔间虽不出现沉淀线，但抗原与标准阳性血清孔间的沉淀线在被检血清孔位置微向内侧弯曲者(见图4中的1号孔），则被检血清判为可疑反应。对该份血清应复检,仍为可疑则判为阳性反应。注：标“+”孔为标准阳性血清，1孔被检血清可疑，2、3孔被检血清阴性。图4被检血清呈可疑反应示意图5.4非特异性反应若抗原孔、被检血清孔之间的沉淀线与抗原孔、标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉，则判为非特异性反应，应重做。