SN 1146-2002烟草环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1146—2002植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法 Plant quarantine-Method for inspectionand identification of tobacco ringspot Nepovirus2002-11-25发布2003-05-0１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1146-2002言前本标准附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈枝楠、郑文华、邓琼、王东勇，本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1146—2002植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了进境植物检疫中对烟草环斑病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于进境植物种子、苗木、繁殖材料和植物产品中烟草环斑病毒的检疫鉴定。2原理烟草环斑病毒（Tohacco ringspot Nepovirus，简称 TRSV)为等轴多面体球状病毒，直径为25 nm～29nm，属线虫传多面体病毒属成员。可侵染54科、246种植物，其中主要的经济作物有：豆类、马铃薯、甘薯、烟草、西瓜、黄瓜、甜瓜、胡萝卜、唐蒲、百合、鸢尾、李属、苹果、葡萄、甜樱桃等。该病毒主耍分布于北美、大洋洲、欧洲、非洲等国家，其有寄主广泛，危害症状明显、免疫原性强、容易制备高滴度、专业性强的病抗血清等特点。通过血清学双抗体夹心法(DAS-ELISA)和鉴别寄主生物学鉴定方法或免疫电镜检测，可以作为检疫工作中检疫鉴定该病的依据。3仪器3.1研钵3. 2微量榨汁机3. 3酶标仪3. 4低速离心机（转速为4000r/min）3.5生物培养箱(具有光照，温度可调范围为0℃～50℃)3. 6酶联板（48孔或96孔）3.7Eppendorf 管(体积为1.5mL)3.8微量移液器（分为100ul、200μl、1000μ单头，100μl.或200μ8孔道一支及相应吸头）3. 9恒温水浴锅或恒温培养箱3. 10分析电子天平3. 11pH计3. 12自瓷盘（40cm×50cm）及钝头镊子3. 13隔离检疫温、网室4 试剂4.1110×PBST缓冲液将氮化钠（NaCI)80 g、磷酸二氢钾（KHzPO,)2g、磷酸氢二钠（Na2HPO,）11.5g、氯化钾（KCI)2 g、吐温 20(Tween-20)5 ml.溶解于1000 ml,蒸馏水中形成的液体。4. 22样品提取缓冲液将亚硫酸钠(Na²SO:）1.3g、聚乙烯基吡咯烷酮（MW24～4000,PVP)20g、叠氮钠（NaN;)0.2g、吐温20（Tween-20）20 mL溶解于1000 mI,PBST 中，用浓盐酸（HCI)调节pH 值至7.4，并储存于4℃。1 SN/T 1146--20024.3包被缓冲液将碳酸钠(NazCO,)1.59 g、碳酸氢钠(NaHCO:)2.93 g、叠氮钠(NaN:)0.2g溶解于 1000 mL蒸馏水中,用浓盐酸(HC1)调节 pH值至9.6,并储存于 4℃C。4.4洗涤缓冲液将 1×PBST缓冲液用浓盐酸(HCI)调节 pH 值至 7. 4,并储存于 4℃。4.5酶标结合物缓冲液将1×PBST缓冲液800mL、小牛血清白蛋白(BSA)2g、PVP(MW24～4000)20 g、叠氮钠(NaNs)0.2g用蒸馏水定容至1000 mL,并储存于4℃。4.6PNPP 底物缓冲液将二乙醇胺97mL、叠氮钠(NaN3)0.2g溶解于1000ml.蒸馏水中，用浓盐酸(HCl)调节pH值至9.8，并诺存于4℃。4.7PNPP 底物溶液将4-硝基酚磷酸钠盐（p-nitrophenylphosphate,英文简称为PNPP)100 mg溶解于PNPP缓冲液100 ml.中,现用现配制。4.8终止反应液将氢氧化钠(NaOH)40 g溶解于1000 mIL.蒸馏水中。4.9种子表面消霉液将30%次氯酸钠100mI.溶解于900mL蒸馏水中制戒浓度为3%的消液。4.10生物试剂可采用烟草环斑病毒检测试剂盒或生物检测试剂。包括烟草环斑病毒抗体（IgG），碱性磷酸酶标记的烟草环斑病毒酶标抗体(IgG-Enzyme-Conjugated)，阳性对照和阴性对照。4.112%醋酸铀染液将2g醋酸铀溶解于98mL蒸馏水中，定容至100 mL，现配现用。注：本标准未作特殊说明，所使用试剂均为分析纯。5现场检疫与抽样5.1抽查按货物批量总件数的5%～20%随机抽查，最低抽查件数10件，不够最低检查数量件数的全部检查。5.2抽样按照附录A的规定随机抽取植物种子、苗木、鳞球茎或其繁殖材料样品。5.3检测样品每批货物送检检测样品种子应不少于1000粒，鳞球茎应不少于2