SN_T 2727-2010饲料中禽源性成分检测方法 实时荧光PCR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2727—2010饲料中禽源性成分检测方法实时荧光PCR方法Determination of poultry derived materials in feedstuff-Real-time fluorescent PCR method2011-05-01实施2010-11-01发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局# SN/T 2727-2010前言本标准按照GB/T 1.1一2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：于凤琴、王金玲、姜莉、王芳、毕英杰、郑秋月、张莹、孟祥勇、庞杰。 SN/T 2727--2010饲料中禽源性成分检测方法实时荧光PCR方法1 范围本标准规定了饲料中禽源性成分(包括鸡、鸭、鹅、鹤鹑)的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于饲料中禽源性成分（包括鸡、鸭、鹅、鹑）的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699饲料采样方法GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求SN/T0800.1进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法3术语、定义和缩略语3.1定义和术语下列术语和定义适用于本文件3. 1. 1实时荧光 PCR real-time fluorescent PCR实时荧光聚合酶链式反应。3. 1.2Ct 值 cycle threshold Ct每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。FAM(6-carboxyfluorescein):6-羧基荧光素TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine):6-羧基四甲基罗丹明4抽样与制样饲料样品的采集参照GB/T14699、SN/T0800.1进行。50g固体样品经粉碎，用120目筛过滤保持其颗粒大小在0.125mm以下。 SN/T 2727--20105　测定方法5.1　原理在 PCR基础上，加入条与模板DNA匹配的、两端有荧光基团标记的寡核苷酸探针。PCR 每进行一次循环,合成的新链数与释放的荧光基团数呈对应关系，即 PCR 产物的量与荧光信号的强度呈对应关系。当荧光信号超过所设定的阈值（Threshold-value)时，荧光信号可被检测出来，仪器检测荧光信号的增加量可以间接地体现样品模板DNA的目的基因的扩增量。样品的模板 DNA进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对饲料中禽源性成分（包括鸡、鸭、鹅、鹑）进行实时荧光 PCR 检测。5.2主要仪器5.2.1均质器(可拆卸、可清洗、可高压灭菌)或研钵。5.2.2电子天平：感量0.01g。5.2.3台式离心机（最高转速15000g）。5.2.4行微型离心机。5.2.5双温水浴(37℃±1℃、65℃±1℃)。5.2.6涡旋振荡器。冰箱(2℃～8℃、-20℃、-80℃)。.8超纯水机（分子生物学级别）。5.2.9高压灭菌锅。5.2. 10实时荧光 PCR仪5.2.11微量可调移液器及配套吸头（2.5 μL～10μL、2 μL～20 μL、10 μL～100 μL、50 μL～200 μL、100 μL~1 000 μL、500 μL~5 000 μL)。5.2.12 离心管(1.5 mL、2 mL、100 mL)。5.2.13金属网筛：120目，孔径0.125mm。5.3主要试剂除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含 DNA和 DNase 的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T27025的规定。5.3.1实验用水：应符合GB/T 6682中一级水的规格。去离子水电阻应达到18.2Q。5.3.2琼脂糖：电泳级。5.3.3RNase A酶溶液：冻干品，不含 DNase,用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为 10 g/L的溶液，分装后于一20℃保存,避免反复冻融。5.3.4CTAB提取缓冲液I:在800 mL去离子水中加人 46.75 g氯化钠,溶解后加人 1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)50mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20 mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠溶液调节溶液的 pH值至 8.0,用水定容至 1 L,分装后高压灭菌。5.3.5CTAB提取缓冲液Ⅱ：在800 mL去离子水中加人46.75g氯化钠,20g溴代十六烷基三甲胺(CTAB),完全溶解后加人 1 mol/L Tri