SN_T 4178-2015南瓜花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4178—2015南瓜花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Squash mosaic virus2015-09-01实施2015-02-09 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局查真伪，途握 SN/T 4178—2015前言本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、武汉哇哇噻纳技术开发有限公司。本标准主要起草人：廖富荣、黄迎波、林石明、梁新苗、吴媛、陈青、邓丛良、赵晓丽、聂棱、陈红运。 SN/T 4178-2015南瓜花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了南瓜花叶病毒血清学、分子生物学的检测和鉴定方法，本标准适用于植物上南瓜花叶病毒的检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1809进出境植物种子检疫规程SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3南瓜花叶病毒基本信息中文名称:南瓜花叶病毒英文名称:Squash mosaic virus缩写:SqMV分类地位：小RNA病毒目（Picornavirales）、伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae）、豇豆花叶病毒属（Comovirus）成员。传播方式：种子传播、昆虫介体传播和机械传播。SqMV 的其他信息参见附录 A。4　方法原理南瓜花叶病毒血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据。5仪器设备与试剂5.1主要仪器设备与用具本标准主要涉及到的仪器设备和用具为：植物汁液提取仪、研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器（1000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2 μL）。5.2主要试剂与配制血清学试剂及其缓冲液配制见附录B,分子生物学试剂及其缓冲液配制见附录C和附录D。1 SN/T 4178--20156 检测与鉴定6.1抽样检查按照SN/T2122、SN/T1809给出的方法进行抽样、取样。6.2隔离种植对于种子样品，一方面，可用种子直接检测（如取6g的种子,研磨粉碎后检测）；另一方面，可先隔离种植后用苗进行检测。隔离种植:在温室或植物生长箱等隔离条件下播种,至2片～3片叶后观察。对于疑似病毒症状的植株，用以下方法（如DAS-ELISA、RT-PCR等)进行检测；对于未表现症状的植株，取约10株为一混合样品，用DAS-ELISA方法检测。6.3血清学检测6.3.1 DAS-ELISA 检测按附录B给出的方法，进行DAS-ELISA检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照,样品提取缓冲液作空白对照。6.3.2免疫层析检测按试剂操作说明，进行免疫层析检测。6.4分子生物学检测6.4.1 RT-PCR 检测按附录C给出的方法，进行RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照,并设置空白对照。6.4.2IC-RT-PCR 检测按附录 D给出的方法，进行IC-RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照,并设置空白对照。6.4.3序列测定与分析RT-PCR 或 IC-RT-PCR 检测阳性的样品，可进一步进行序列测定分析。把测定的序列与已知序列进行比对,以确定是否为 SqMV序列。注：根据国际病毒分类委员会(ICTV)第九次分类报告中伴生豇豆病毒科（Secoviridae)病毒种类的分类标准，其中关于基因组序列的判定依据为:CP的氨基酸序列一致性小于 75%。７ 结果判定7.1当血清学检测(DAS-ELISA或免疫层析）和分子生物学检测（RT-PCR或IC-RT-PCR)结果均为阳性时,则判定为检出 SqMV。7.2当分子生物学检测（RT-PCR 或 IC-RT-PCR)结果均为阳性、测定的序列为 SqMV 序列时,则判定2 SN/T 4178—2015为检出 SqMV。8结果记录记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸光值的数据，分子生物学检测结果保存电泳照片，免疫层析检测结果保存照片。9样品保存阳性的样品应妥善保存在低温或超低温冰箱中，并做好登记和标识，以备复核。3 SN/