SN_T 1439-2013国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1439--2013代替SN/T1439—2004国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法Molecular detection methods of Ebola virus at frontier ports2013-03-01发布2013-09-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局邮 SN/T 1439—2013創言前 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1439一2004《国境口岸埃博拉出血热病毒检验规程》。本标准与SN/T1439—2004相比，主要技术变化如下：修改了标准的中英文名称；一原标准提供的检测方法，如病毒分离培养、电子显微镜检查、间接免疫荧光试验、免疫印迹试验等都涉及活病毒，必须在 BSL-4实验室内才能进行，基本不具备可操作性，因此，本标准结合生物安全要求,将原标准中的方法全面进行了修改。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：黄吉城、李燕、师永霞、郑夔、李小波、洪烨、幸芦琴、相大鹏、郭波旋、钟玉清、莫秋华、史咏梅。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1439---2004。 1SN/T 1439--2013国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法1 范围 本标准规定了国境口岸埃博拉出血热疑似病例血清标本中埃博拉病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，苏丹埃博拉病毒和扎伊尔埃博拉病毒常规RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测以及埃博拉病毒基因芯片法等检测方法。本标准适用于国境口岸入出境人员埃博拉出血热疑似病例临床标本中的分子生物学检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1埃博拉出血热Ebola hemorrhagic fever;EHF由埃博拉病毒(Ebola virus,EBV)引起的一种急性出血性传染病。人主要通过接触病人或感染动物的体液、排泄物、分泌物等而感染，临床表现主要为发热、出血和多脏器损害。埃博拉出血热的病死率高，可达50%～90%。本病于20世纪70年代在非洲首次发现，主要在非洲的乌干达、刚果、加蓬、苏丹、科特迪瓦、利比里亚、南非等国家流行。3.2埃博拉病毒Ebola virus又称埃博拉出血热病毒，属丝状病毒科，为单股负链RNA病毒，是至今人类所知的最为恐怖的病毒之一，被世界卫生组织（WHO）列为潜在的生物战剂病原体。可分为四种不同亚型：扎伊尔埃博拉（EBO-Z）、苏丹埃博拉（EBO-S)、科特迪瓦埃博拉（EBO-C)和莱斯顿埃博拉（EBO-R）。前3种亚型可使人和灵长类动物发病。4缩略语下列缩略语适用于本文件。RT-PCR:反转录-聚合酶链反应实时荧光RT-PCR:：实时荧光反转录-聚合酶链反应Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数RNA:核糖核酸FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团1 SN/T 1439—20135生物安全要求埃博拉出血热疑似病例血清标本中相关材料的生物安全要求按GB19489执行，如：埃博拉病毒相关的感染性材料的操作应在生物安全三级（BSI-3或ABSL-3)实验室内进行；埃博拉病毒相关的灭活材料的操作应在生物安全二级（BSL-2)实验室内进行；埃博拉病毒的病毒培养物运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。6标本的采集、运输和保存无菌采集疑似病例发病1周内静脉fi3mL～5mL，宝温静笠30min使其凝固，500g离心10min，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号绝记上编号，低温送到实验室检测。如24 h 内不能送到实验室,将血清置于70-℃保荐。7 标本的处理血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，如不能在-24-h-内检测应存放在一70℃冰箱。8分子生物学检测8.1 RT-PCR 法8.1.1主要仪器本方法使用的主要仪器如下，-PCR扩增仪；千分之天平；超净工作台；-Ⅱ级生物安全柜；高压灭菌锅;低温高速离心机：最大离心为_20000电泳仪；凝胶成像分析系统；旋涡振荡器；冰箱:4℃、-20℃和一70℃;-移液器:10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和 1 mI.;恒温水浴锅。8.1.2 主要试剂除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用德国 Qiagen 公司 QIAamp Viral RNA Kit!)提取病毒核酸;