SN_T 2856-2011非洲马瘟检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2856—2011非洲马瘟检疫技术规范Quarantine protocol for African horse sickness2011-12-01 实施2011-05-31发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局码牙花 SN/T 2856—2011前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准参考了国际动物卫生组织《陆生动物诊断试验与疫苗手册》(2008版）中2.5.1章“非洲马瘟诊断技术”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邓明俊、肖西志、朱来华、凌宗帅、郑小龙、孙敏、梁成珠、花群义、周晓黎、高志强。 SN/T 2856—2011非洲马瘟检疫技术规范1范围本标准规定了非洲马瘟的临床诊断要点、非洲马瘟实验室病毒分离技术、反转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR）、实时荧光 RT-PCR 检测技术、RT-PCR分型鉴定技术、血清中和试验（SNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等实验室操作的技术要求。本标准适用于进出口马、驴、骤等马属动物非洲马瘟的检疫、诊断和血清学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T18088　出人境动物检疫采样GB19489　实验室　生物安全通用要求3临床诊断3. 1 发病症状首先使个体或群体马保持安静，观察其精神状态、呼吸状况、站立姿势；注意观察头部、颜面及体表是否出现特征性水肿。其次，观察马匹运动状况，是否有行动迟缓、行为异常等现象。在临床诊断观察中应重点注意以下几点：马匹表现出严重的呼吸道症状，呼吸频率达60次/min甚至75次/min，出现不同程度的呼吸a）困难,在数小时内突然死亡;马匹站立时前腿分开、头向前伸、鼻孔扩大，呈现出痉挛性咳嗽，同时从鼻孔向外流出泡沫样b）液体；马匹呈现急性发热或弛张型发热，持续1d～2d或5d～8d,最高体温可达40℃～41℃；c）出现特征性水肿，主要表现在颜部、眶上窝和眼脸、嘴唇、面颊、舌部、下颌骨间，有的皮下水肿d)1可扩展到颈部至胸部；结膜和舌腹侧以及皮下有出血点;e）f）厌食和精神抑郁,有的烦躁不安，表现出类似疝痛症状。非洲马瘟相关资料参见附录 A。3.2 病理变化病理剖检应注意观察以下要点：a）项韧带水肿;b）畜体肌肉间隙水肿并呈胶冻样；c)多处组织淤血并形成大量淤斑； SN/T 2856—2011d）肺部组织水肿（近一半感染动物出现这一特征）；e）皮下组织呈现黄色胶冻样水肿；f）心包积水、体内大量腹水；g）1盲肠和结肠浆膜表面有很多点状出血。 实验室诊断44.1病毒分离鉴定注：非洲马瘟病毒分离操作过程应该在具有三级生物安全的实验室内完成。4.1.1试剂与材料Vero 细胞或 BHK-21细胞。4. 1. 1. RPMI1640 培养基或其他等效培养基。胎牛血清。青霉素、链霉素。肝素。各种常规试剂及细胞培养相关耗材。设备4. 1.24. 1.2.1超净工作台或生物安全柜。高速冷冻离心机。倒置光学显微镜。4. 1.2.4二氧化碳细胞培养箱。4. 1.2.5高压灭菌锅。4.1.3样品采集血液样品颈静脉无菌采集动物的肝素抗凝血，置20℃,保存备用。组织样品无菌采集动物的脾、肺、淋巴结等组织，保温盒加冰冷藏保存，迅速送往指定的实验室。若需长期保存,置一70℃。4.1.4组织样品的前处理取采集的组织 2g～4 g,以 pH 7.2 的 PBS液将其研磨成 10%的悬液。悬液中加人青霉素(终浓度为100 IU/mL)、链霉素（终浓度为100 μg/mL)，1000r/min 离心10 min，收取上清液一5℃～一30℃保存备用。4.1.5 病毒增殖 血样培养状态良好的Vero 细胞或BHK-21细胞。无菌抗凝血样勿需稀释可直接用于接种细胞：取适量血样样品接种单层细胞，37.℃吸附60min。充分洗涤后加维持液，置37℃5%二氧化碳培养箱培养。血液样品也可先用pH 7.2的 PBS液或细胞培养液洗涤两次，然后反复冻融（充分裂解，以排除血2 SN/T 2856—2011液中可能含有的抗体对游离病毒的中和，同时促进病毒从红细胞中大量释放）。用含抗生素的PBS液对裂解的血样做1：10稀释,接种单层细胞进行病毒增殖。24 h后逐日观察细胞病变(CPE),连续观察8 d.组织样品培养状态良