SN_T 4723-2016根结线虫属（非中国种）检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4723—2016根结线虫属（非中国种)检疫鉴定方法Detection and identification of Meloidogyne spp.(non-Chinese species)2017-07-01 实施2016-12-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局密查真伪 SN/T 4723—2016前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、南京农业大学、华南农业大学本标准主要起草人：顾建锋、王金成、何洁、张慧丽、王暄、李芳荣、林宇、卓侃、 SN/T 4723—2016根结线虫属（非中国种）检疫鉴定方法1 范围本标准规定了根结线虫Meloidogyne 中国种与非中国种的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境植物、植物产品、土壤和介质等传带的根结线虫的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T24829毛刺线虫属（传毒种类）检疫鉴定方法SN/T1157进出境植物苗木检疫规程伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法SN/T 21173根结线虫属线虫基本信息学名:Meloidogyne Goeldi,1887英文名:Root-knot nematodes分类地位：垫刃目（Tylenchida），垫刃总科（Tylenchoidea），纽带科（Hoplolaimidae），根结亚科（Meloidogyninae），根结线虫属（Meloidogyne）。传播途径：带线虫根组织、球根、球茎和被污染的土壤都是根结线虫传播的主要载体。远距离传播主要借助于受侵染的植物繁殖材料的调运；农事操作中农机具和人员等的黏带以及灌溉和风雨运动可造成近距离扩散。根结线虫属其他相关信息参见附录A。根结线虫属线虫为植物根系、球根、球茎等地下组织的专性内寄生线虫，其寄主及分布范围均十分广泛。目前该属已知线虫 98 种，其中最常见的是南方根结线虫M.incognita、花生根结线虫M.arenaria、爪哇根结线虫M.javanica、北方根结线虫 M.hapla 和象耳豆根结线虫M.erterolobii，我国已有记录近40种，其中23种确定为中国种（参见附录B）。4　方法原理根结线虫二龄幼虫线形，在根及根围土壤中活动，入侵寄主根部后固着寄生，逐渐发育为卵圆形雌虫，导致寄主根部膨大呈根瘤状。因此，如发现疑似根结，可直接剖检获得雌虫，也可从寄主植物根系及根围土壤或介质中分离获得二龄幼虫或雄虫。获得线虫后，根据其雌虫、雄虫和二龄幼虫形态，判别其是否为根结线虫属，然后进一步用形态学和分子生物学相结合的方法，并参考其寄主、地理分布等信息，判断其种类。目前已经报道的根结线虫共98种，其中40种在我国曾有报道。根据文献报道频次、分布是否广泛、描述是否充分等,将其中 23种作为中国种,其余17种是否为中国种有待进一步核实。若判断其非1 SN/T 4723-2016该方法所述的23种中国种之-，根据检疫风险原则，可判定为非中国种，并应联系有关鉴定专家进行鉴定。5器材和试剂5.1仪器设备和器具PCR仪、冷藏箱、体视显微镜、生物显微镜、超低温冰箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌锅、微波炉、烘箱；漏斗、医用解剖刀、载玻片、盖玻片、酒精灯、线虫挑针、PCR管、24孔细胞培养板、可调式微量移液器(2 μL～1 000 μL)及相应的吸头。5.2主要试剂除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。甲醛、乙醇、甘油、蜡块、指甲油、2× Taq MasterMix 预混液、10 × EasyTaq 缓冲液、蛋白酶 K（20 mg/mL）、无RNase无菌水、100 bpMarker、EB染料、50×TAE溶液、琼脂糖凝胶。6现场检疫与取样6.1 症状检查现场检疫时应挖取寄主植物根部，观察根上是否有根结或疙瘩状变异，或生长不良、腐烂、变色、畸形等症状。6.2取样按照SN/T 2117进行抽样和取样，对有根结等症状的重点取样。如无症状，则随机取样。对于进境苗木，如数量≤5株，要求对每株单独取1份样品。每份样品重量≥0.5kg，取样深度为20cm左右，要求多带些根。数量5株，则要求取样5份以上。样品置密闭塑料袋中，标明品名、报检号、来源国、检测要求等信息，及时送实验室检测。如小苗带土较少，则尽可能多取根和土样，不带土的苗应仔细检查根部。土