SN_T 3267-2012国境口岸炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3267-2012国境口岸炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片检测方法Detection method for Bacillus anthracis by gene suspensionarray at frontier ports2013-05-01实施2012-10-23发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3267—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局。本标准主要起草人：孙肖红、韩辉、杨宇、文海燕、王惠兰、胡孔新、张顺合、王静。1 SN/T 3267--2012国境口岸炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片检测方法1范围本标准规定了国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌基因悬浮芯片的检测方法和程序。本标准适用于国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌的检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489　实验室　生物安全适用要求。人间传染的病原微生物名录（卫生部）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3. 1炭疽芽胞杆菌Bacillus anthracis:炭疽芽胞杆菌属于芽胞杆菌属，是急性传染病炭疽的病原体，为粗大的革兰氏阳性杆菌，具有强烈一的致病性、传染性和生存能力，人类可以通过直接或间接接触炭疽芽胞杆菌引起皮肤、肺和肠道感染，由于曾经被用作细菌战剂，尤其是2001年美国发生炭疽恐怖事件之导致皮肤炭疽、肺炭疽和肠炭疽。后，炭疽芽胞杆菌更加受到全球的密切关注。3.2基因悬浮芯片gene suspension array基因芯片是将探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测探针分子的杂交信号强度，进而获得样品分子的数量和序列信息。基团悬浮芯片是近年来新出现的一种可对多指标同时进行定性、定量分析的新型芯片技术，是一种既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台。悬浮芯片体系由许多不同的微球为主要基质构成，每种微球上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于固定探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些微球悬浮于一个液相体系中，就构成了一个悬浮芯片系统。3.3荧光强度中位值median fluorescence intensity,MFI用仪器检测结果时，读取一种编号微球群100个或以上的每个微球信号强度的统计平均值。 SN/T 3267-20124仪器和设备4.1悬浮芯片系统　美国BIO-PLEX!或其他产品。4.2微孔滤板吸滤器，气泵。4.3酶标板振板器。4.4 PCR 仪。4.5超声波破碎仪。5 试剂与耗材5.1 PCR 相关试剂参见附录 A。5.2基团悬浮芯片检测相关试剂参见附录 B。5.3 其他6mol/L碘化钠；70%乙醇；Tris饱和酚；三氯乙烷；玻璃粉；10%的次氯酸钠溶液（含有效氯10%)。5.4捕获探针BA-1:5-NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGT-3BA-2 :5-NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCC-35.5 引物BA-1-F(上游引物）:5′-TGGACGCATACGAGACATAAT-3BA-1-R(下游引物）:5-TGCTTTAGCGGTAGCAGAGG-3,扩增产物长度为430 bp。BA-2-F(上游引物):5-TTTCATAATCATGGATTTCCCG-3BA-2-R(下游引物):5-TTACCCAACATCATCTTCGCA-3，扩增产物长度为212 bp。5.6耗材5.6.1微球：LUMINEXI或其他代理公司的任何编号的羧基化荧光编码微球。5.6.2链亲和素-藻红蛋白:Streptavidin-phycoerythin,SA-PE。5.6.3血球计数板。6基因液相芯片的制备(探针与微球的偶联)6.1将已经分装好的碳化二亚胺(EDC)粉末从20℃取出，回温至室温。6.2将氨基化探针用纯水配置终浓度为100μmol/L溶液。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 SN/T 3267—20126.3将原包装中的微球振荡 30 s,超声 30 S。6.4取100μL微球至1.5mL离心管,14000g离心4mi