SN_T 5125-2019水生动物副溶血弧菌和霍乱弧菌双重实时荧光检测方法.pdf

ICS 65.020.30B 41SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5125—2019水生动物副溶血弧菌和霍乱弧菌双重实时荧光检测方法Duplex real-time PCR for Vibrio Parahaemolyticus and Vibrio Choleraein aquatic animals2019-09-03发布2020-03-01实施：中国海南出版社有限公司中华人民共和国海关总署发布HG944440000760nskb.cof［：刮开涂层数活密码 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准水生动物副溶血弧菌和霍乱弧菌双重实时荧光检测方法SN/T 5125—2019*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023）编辑部：(0107509网址 /book中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷?开本880×12301/16印张0.5　字数14千字2020年3月第一版　2020年3月第一次印刷印数 1-500*书号：155175·201 SN/T 5125—2019前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海海关、中国农业科学院上海兽医研究所。本标准主要起草人：王艳、蒋蔚、黄忠荣、王权、熊炜、李健。 SN/T 5125--2019水生动物副溶血弧菌和霍乱弧菌双重实时荧光检测方法1范围本标准规定了水生动物中副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重实时荧光PCR快速检验方法。本标准适用于水生动物中副溶血弧菌和霍乱弧菌的快速检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.7食品安全国家标准‧食品微生物学检验副溶血性弧菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct 值:循环阈值(cycle threshold)。Taq 酶: Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)。4仪器和耗材4.1全自动荧光定量PCR仪。4.2高速台式冷冻离心机。4.3普通台式离心机。4.4旋涡振荡器。4.5旋转刀片式或拍击式均质器。4.6冰箱:4℃±1℃,一20℃±2℃。4.7微量可调移液器及配套吸头。4.81.5 mL Eppendorf 管。4.910 mL离心管。4.10灭菌样品处理器具：剪子、镊子。4.11一次性手套。4.12生物安全柜。5主要试剂除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，实验用水为双蒸水（见GB/T6682)。5.13%氯化钠碱性蛋白陈水:见附录 A中 A.1。5.2 灭菌双蒸水。T SN/T 5125--20196操作方法6.1样品制备6.1.1鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。6.1.2以无菌操作取样品25g(mL），加人3%氯化钠碱性蛋白陈水（5.1)225mL，用旋转刀片式均质器以8000 r/min均质1min，或拍击式均质器拍击2min，制备成1：10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225mL3%氯化钠碱性蛋白陈水（5.1)中取少量稀释液加人无菌乳钵，样品磨碎后放人500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1次～2次，洗液放人锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1：10的样品匀液。（见GB4789.7）6.2　增菌培养将6.1.2制备的1：10样品匀液于37℃，180r/min振荡培养12h～18h。6.3模板DNA的提取取1mL培养菌液于1.5mL无菌离心管中,8000r/min离心5min，尽量弃去上清液，加人1mL灭菌双蒸水(5.2)清洗1次后离心，同样尽量弃去上清液。加人100μL灭菌双蒸水(5.2)充分混匀，进行沸水浴10min，10000r/min离心5min，将上清液转移至新管备用。注：可以采用等效商品化DNA提取试剂盒进行操作。6.4双重荧光 PCR 检测引物及探针序列6.4.1引物及探针序列见表1。表 1双重荧光 PCR检测引物及探针序列产物片段大小/bp引物及探针序列(5′→3)扩增基因TCCGTCAGATTGGTGAGTATCAGA98TGCTCAATAGAAGGCAACCAGTTV.parahaemol yticus ToxRFAM-TGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATC-BHQGCTACCAAGAAGGTGACTT