SN_T 5096-2019国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.020C 62SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5096—2019国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR 检测方法Real-time RT-PCR method for detecting Lone Star virusin ticks at frontier ports2019-09-03 发布2020-03-01 实施深中以海南出版社有限公司HG944440010802中华人民共和国海关总署发布刮开冻层激活密码 SN/T 5096—2019前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司、中华人民共和国呼和浩特海关。本标准主要起草人：刘丽娟、曹晓梅、马爱敏、胡孔新、杨宇、徐宝梁、郭天宇、张胜、王静。 SN/T 5096--2019国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光 RT-PCR检测方法，包括样本前处理、检测程序、方法、结果判定及报告。本标准适用于对蜱传孤星病毒的检测。规范性引用文件2下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1293国境口岸蜱类监测规程WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部公告2006年第15号）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1孤星病毒Lone Star virus ；LSV布尼亚病毒科白病毒属成员，是单股负链节段性 RNA病毒，有 S、M 和L片段。其中，L片段编码 RNA 依赖性 RNA 多聚酶，M 片段编码糖蛋白 Gn 和 Gc，S 片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白。孤星病毒主要经蜱传播，经蜱叮咬后，人可能出现蜱传斑点热等症状。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（base pair）Ct 值：循环阈值（cycle threshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（diethyl pyrocarbonate）FAM：6-羧基－荧光素（6-carboxy-fluorescein）RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）ROX：6-羧基-x-罗丹明（6-carboxy-x-rhodamine）RT-PCR：逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reation）1 SN/T 5096—20195 检测对象5.1国境口岸现场采集的蜱虫样本。5.2疑似被蜱虫叮咬且不能排除孤星病毒感染的人员。6生物安全和PCR防污染要求6.1生物安全要求按照GB19489和《人间感染的病原微生物名录》的要求，孤星病毒相关材料的生物安全要求如下：未经培养的孤星病毒感染性材料的操作应在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行；孤星病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行；孤星病毒感染性材料运输和包装分为B类，UN编号为UN3373。6.2PCR 防污染要求PCR防污染措施按WS/T230的规定执行。7仪器7.1荧光定量PCR仪。7.2二级生物安全柜。7.3高压灭菌器。7.4-70℃超低温冰箱。7.5 冷冻离心机。7.6旋涡振荡器。8 试剂8.1DEPC 水DEPC 处理过的不含 RNA 酶的水。8.2RNA 提取试剂盒QIAampViral RNAkit，详见试剂盒说明书，内含AVL、AW1、AW2和AVE等1）8.3步法荧光 RT-PCR 试剂盒Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit)。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 SN/T 5096--20198.4引物和探针序列见表 1。表 1引物和探针序列监测期序列（5′-3）引物/探针名称FCTTCCTTAACCCTCAGATAR扩增片段为134bpCCTCTTTATGGTCCCTTAProbeFAM- TCATCAACATCTCGTCTCATTCGCT -BHQ1注：探针的5’端标记的是FAM荧光报告基团，3’端标记的是BHQ1荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和淬灭基团或等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。9检验程序9.1样本采集9.1.1蜱虫样本的采集按照 SN/T1293执行。9.1.2人血清样本的采集无菌采集疑似病例发病3d内静脉血 3mL~5mL，室温静置30min使其凝固，1500 z/min~3 000